动物产品中莱克多巴胺的残留检测研究进展

李 苗，马月姣，李建成*

(1.中国农业大学动物源性食品安全检测技术北京市重点实验室，北京 100193；2. 中国农业大学动物医学院，北京 100193)

2019年6月，中国海关部门在查验一批来自加拿大的输华猪肉产品时检出莱克多巴胺(Ractopamine, RAC)，动物性产品尤其是猪、牛可食用部分含有“瘦肉精”引发人们的热议。2021年3·15晚会中河北沧州青县被曝出当地存在大范围的违规使用瘦肉精现象，再次使得关于RAC残留检测方法的研究备受关注。20世纪60年代，一种β-肾上腺素能受体激动剂药物盐酸克伦特罗，由美国Cyanamid公司首次研制，用于治疗呼吸道疾病，因为能促进禽畜增加瘦肉率，1978年开始用于饲料研制。90年代初，添加于我国猪饲料中，1997年，在香港发生猪内脏中“克伦特罗”中毒事件，我国严禁在养殖中使用盐酸克伦特罗[1]。RAC是第二代“瘦肉精”，一类毒性低于盐酸克伦特罗的新型“瘦肉精”，代谢较快，检测相对困难，曾在畜牧生产上被用来代替盐酸克伦特罗使用[2]。RAC能促进动物机体营养再分配，加速蛋白质沉积及肌肉生长，抑制脂肪的合成，促进胴体生长与改善品质[3-4]。因为RAC还有增加肌肉量和肺活量的作用，某些运动员为使自己夺冠而刻意食用，被国际奥委会列为禁用药物。同时，RAC的化学性质稳定，在烹任动物性食品时，并不能破坏RAC结构，食用含有RAC动物性食品时可能会引起急性中毒及四肢肌肉颤动，心律失常，血压升高，长期食用可能诱发恶性肿瘤。

RAC在动物肝脏、肾脏残留量高，肌肉中残留量低，因此，以肉类为主的美国、澳大利亚、加拿大等国允许使用RAC。2011年我国工信部、农业部、商务部、原卫生部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局六部委发布联合公告(2011年第 41 号)，要求即日起在我国境内禁止RAC的生产和销售。然而我国畜禽肝脏、肾脏的消费量大，2020年我国农业农村部为进一步规范养殖用药行为，根据《兽药管理条例》有关规定，修订并发布《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》(农业部公告第 250 号)，禁止动物养殖中使用RAC。虽明令禁止，但“瘦肉精”事件仍频繁发生。

1 RAC简介

1.1 理化性质 RAC又名雷托巴安、舒喘灵、权莱克、金莱多巴、Paylean。化学名称为4-[3-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)-乙基]氨基丁基]苯酚(4-[3-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl]aminobutyl]phenol)，主要以盐酸盐(RAC·HCl)的形式存在，分子式C18H23NO3·HCl，分子量为337.83，密度1.189 g/cm3，化学结构如图1所示，含有3个活性基团(碱性酚、对羟甲基酚和仲胺，pH分别为11.01、9.21、8.85)，属于苯基乙醇胺类化合物。在RAC的结构中，主要的活性部位是伯氨基和酚羟基，乙醇胺基与细胞上β2受体结合后激活腺苷酸环化酶，使三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)转化成环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)，活化蛋白、激酶，诱发动物体内一系列酶的磷酸化过程，从而实现机体营养再分配，有研究表明，细胞膜上的上β2受体可与RAC结合，提高动物皮下脂肪中cAMP浓度，抑制脂肪合成，促进脂肪分解[5]。常温状态下RAC呈白色或近白色结晶性粉末状，化学性质稳定，分解温度为165 ℃，因此一般加热方式不能破坏其结构，可溶于水，其水溶液pH为9.4，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，微溶于丙酮，皮肤接触可发生过敏反应，在pH﹥7时以非离子化形式存在，易被乙酸乙酯有机溶剂作为萃取剂从水等溶液中萃取出来，该方法可用于待测样品的前处理[6]。

图1 RAC结构示意图Fig 1 The schematic diagram of RAC structure

1.2 RAC残留限量标准 世界各国在养殖业中对RAC的使用有不同的规定(表1)，国际食品法典委员会规定猪、牛的肾脏、肝脏、肌肉及脂肪中残留限量分别为0.09、0.04、0.01 mg/kg；美国规定猪肉、猪肝脏、牛肉、牛肝脏残留限量分别为0.05、0.15、0.03、0.09 mg/kg，火鸡肌肉、肝脏中残留限量分别为0.1、0.45 mg/kg；加拿大规定猪肉中残留限量为0.04 mg/kg；中国、欧盟、日本、新西兰禁止使用RAC为饲料添加剂或在动物饮用水中加入RAC，日本与新西兰允许进口猪肉中含有RAC，最大残留量均为0.01 mg/kg[7]。

表1 RAC残留限量标准Tab 1 RAC residue limit standard

2 RAC检测方法研究进展

我国是畜牧生产和消费大国，生猪产量占全球一半，即使如此，每年仍需要从国外大量进口，而进口猪及产品并不能保证其可食组织中没有RAC。目前常用RAC检测方法有高效液相色谱法[8]、超高效液相色谱-串联质谱法[9]、酶联免疫吸附法[10]、免疫层析法[11]、化学发光法[12]、电化学免疫传感器检测法[13]等。

2.1 RAC传统仪器检测方法 传统仪器检测方法多为高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱联用法、超高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱联用法。

2.1.1 高效液相色谱法 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography， HPLC)即采用合适的有机试剂将RAC提取出来，经过液-液萃取净化和选择适当的色谱条件(色谱柱种类、流动相、柱温、室温、激发波长、发射波长及进样量)，使用色谱峰面积定量测定RAC。2016年Tang[8]建立以 Fe3O4磁微粒结合分子印迹聚合物(Fe3O4@MIPs)为吸附剂的HPLC-荧光(Fluorescence detection，FD)检测方法，用于检测猪肉样品中RAC，LOD为0.05 μg/kg，LOQ为 0.17 μg/kg，回收率为 73.60%～94.50%(RSD<11.17%)，在0.5～100.0 μg/kg范围内线性良好，该方法具有良好的重现性以及高灵敏度。2015年Ding[14]提出了一种快速的HPLC-紫外检测(Ultraviolet，UV)方法，检测猪肉样品中 LOD为0.045 μg/g，LOQ为0.149 μg/g，在0.15～100.0 μg/g浓度范围内建立了线性关系，回收率为80.3%～96.1%，RSD为4.1%，该方法灵敏度远不如Tang所建立的方法。2021年Peng[15]开发了一种简便的管内固相微萃取程序，用于在HPLC-UV分析前富集猪肉中的RAC，LOD为0.64 ng/g，LOQ为1.95 ng/g，回收率在85.2%～108.1%之间，线性范围为2.0～800 ng/g，与常规样品预处理方法相比，这种管内固相微萃取方法具有操作简单，有机溶剂消耗低等优点，但灵敏度没有Tang所建立的方法高，总的来说该方法相比于上述方法具有良好的回收率以及较广的检测范围。

2.1.2 高效液相色谱-串联质谱联用检测法 高效液相色谱-串联质谱(High performance Liquid chromatography linked to tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)检测方法，以高效液相色谱为分离系统，质谱为检测系统。2020年李丽珍[16]等应用HPLC-MS/MS建立猪肉中莱克多巴胺的残留检测方法，采用正己烷净化实现基质净化效果，节省检测成本，检测RAC的LOD为0.15 μg/kg，LOQ为0.25 μg/kg，线性范围0.5～5 μg/kg，在猪肉中检测RAC回收率为88%～99%(RSD<16.18%)，该方法灵敏度良好但方法的精密度还需改良。2018年Kyunghun Jeong[17]开发了一种LC-MS/MS检测牛组织中的RAC，测得 LOD、LOQ分别为1.7 ng/g和5.0 ng/g，回收率为74%，该方法灵敏度、精确度及回收率在实际应用中不足够。2018年Kaylee R[18]使用LC-MS/MS开发并验证了猪肉中10种β肾上腺素能激动剂的检测，该方法提取残留物时间小于20 min，LC-MS/MS总运行时间为9.6 min，测得猪肉中RAC的LOD为0.2 ng/g，LOQ为0.7 ng/g，10种β肾上腺素能激动剂回收率均大于85%，相比于同年Kyunghun Jeong开发的方法具有良好的灵敏度。2017年Sun[19]提出了建立了一种采用免疫亲和柱(IAC)净化结合LC-MS/MS方法测定了猪肉及猪肝及鱼肉中的RAC，LOD为0.009 μg/kg，LOQ为0.03 μg/kg，线性范围0.05～25 μg/L，回收率分别为89.8%～99%、87.6%～91.5%、87.6%～96.1%，该方法相比于以上两种方法具有良好的灵敏度和精密度以及良好的回收率。

2.1.3 超高效液相色谱-串联质谱法 超高效液相色谱-串联质谱(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)检测方法具有分析时间短、灵敏度和选择性更高的优点，使用非常广泛。2019年Suo[20]开发了一种用UPLC-MS/MS，测得动物产品血粉中RAC的检测限(Limit of detection，LOD)为0.32 μg/kg，定量限(limit of quantification，LOQ)为1 μg/kg，线性范围为2～200 ng/g，在各类血粉中回收率为76.6%～98.6%，相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)<14.8%。2020年Cao[21]等开发了制备了4-苯乙烯磺酸钠官能化聚丙烯腈纳米纤维垫(SS/PAN-NFM)作为96孔板固相萃取吸附剂，结合UPLC-MS/MS检测猪肉中RAC，LOD为0.24 μg/kg，LOQ为0.8 μg/kg，线性范围为1～100 μg/kg，回收率为91.4%～111%(RSD<11.9%)，该方法相比于Suo所建立的具有更好的回收率以及更高的灵敏度及精确度。2021年Wu[22]用超高性能液相色谱和高分辨率串联质谱法(Ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)通过直接编织法合成了一种具有高表面积的有机聚合物(PPOP)作为牛奶中RAC固相萃取新型吸附剂，洗脱液通过UPLC-HRMS分析。RAC的回收率为97.4%～106.8%，RSD为1.3%～5.1%，LOD为0.02 ng/g，LOQ为0.05 ng/g，线性范围为0.05～250 ng/g，相比于上述两种方法该方法表现出高灵敏度、高精确度以及很好的重现性。

2.1.4 气相色谱-质谱联用检测法 气相色谱-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)可分离尚未分离的色谱峰，定性能力高，可以明显提高定量分析精度，但它的不足在于分析对象仅限于在 300 ℃左右可以汽化与离子化的样品，在加热过程中易于分解、极性太强的化合物不能直接检测，需要进行酯化衍生处理才可进行检测，若不能汽化或衍生化则不能采用此法。根据报道，用于检测猪组织中RAC残留量的GC-MS方法较少。2019年赵敏儿[23]通过优化提取条件，建立了气相色谱-质谱法测定猪肝中RAC残留量的分析方法，LOD为 2.0 μg/L，回收率为94.2%～108.2%，RSD为3.3% ～ 4.9%，线性范围2～40 μg/kg。该方法回收率高，其准确度和精密度能满足兽药残留分析检测的要求。2017年Liu[24]建立了新型搅拌棒阵列吸附萃取(Stir bar sorptive extraction，SBSE)和GC-MS同时测定猪肉样品中RAC，LOD为0.091 ng/g，LOQ为0.253 ng/g，回收率为85.7%～93.9%(RSD<10%)，线性范围为0.5～100 ng/g，与赵敏儿建立的方法相比该方法灵敏度较高。RAC仪器检测方法比较结果见表2。

表2 RAC仪器检测方法比较Tab 2 Comparison of traditional instrument detection methods

2.2 RAC的快速检测方法 相比传统仪器检测而言，快速检测在短时间内就可进行大量初步筛查，快速检测方法多为酶联免疫吸附法、化学发光快速检测法、胶体金免疫层析法、时间分辨荧光免疫分析方法。

2.2.1 酶联免疫吸附法 因传统检测方法受净化程序复杂，耗时耗力，仪器昂贵，需要熟练检测人员等条件制约，如何快速简便低成本的检测RAC已成为近年来研究热点。相比于仪器方法，酶联免疫吸附剂法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)更加快速、简便、灵敏。利用抗原抗体的特异性结合和酶的催化反应原理，根据酶标仪测定 OD450和四参数方程计算，判断RAC的含量及检测方法的灵敏度。2014年Zhang等[25]为了测定动物性食品(鸡肌肉、猪脚、猪肌肉和猪肝)中RAC残留量，利用RAC-BSA产生多克隆抗体和抗体在磷酸盐缓冲液中具有较高的敏感性和特异性，建立一种快速dcELISA方法，测得IC50为0.6 ng/mL，LOD为0.04 ng/mL，灵敏度相对较高。近年来基因工程技术快速发展，单链抗体因具有制备周期短，成本低，易于大量制备而备受研究者青睐，2012年Dong等[26]根据杂交瘤细胞株构建了RAC单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白，并建立了化学发光酶免疫分析法检测猪肉样品，IC50为0.25±0.03 ng/mL，LOD为 0.02±0.004 ng/mL，线性范围在0.05～1.45 ng/mL，虽然检测范围较小，但其灵敏度远高于上述单克隆抗体与多克隆抗体建立的方法，且融合蛋白不与RAC类似物发生交叉反应。Han[27]于2018年建立了一种基于金纳米颗粒的RAC等离子体icELISA，尿中LOD为0.35 ng/mL。2019年Peng[28]制备了针对RAC的特异性单克隆抗体(McAb)以此构建了一种新的ic-ELISA以检测猪尿中的RAC残留，IC50为1.15±0.037 ug/L，LOD为0.35 μg/L，同时回收率为96.7%～108.6%，变异系数低于6.8%，线性范围在0.1～8.1 μg/L，灵敏度不如以上Zhang以及Dong建立的方法，但在实际样品中进行了检测应用并且回收率良好。

2.2.2 化学发光快速检测法 化学发光法(Chemiluminescence，CL)是利用待测物浓度与化学检测体系中的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，通过仪器检测体系的化学发光强度，确定待测物含量。2012年Feng等[29]建立了测定RAC的流动注射化学发光分析方法，LOD为2.5 ng/mL，在最佳实验条件下，RAC在4～800 ng/mL 线性良好。2015年刁雅洁[30]利用镍-鲁米诺流动注射化学发光体系，建立检测β-兴奋剂的方法，RAC的LOD为1.0×10-10mol/L， 检测范围为1.0×10-8～1.0×10-6mol/L，与冯婷的方法相比，稳定性较好。张召香等[31]利用不同胺分子对CdSe量子点电化学发光的增强作用不同，构建了CdSe量子点电化学发光传感器并结合胶束扫集预富集技术，使量子点电化学发光信号增强6000倍， 从而建立了一种基于胶束反向扫集的毛细管电泳量子点电化学发光新方法，用于猪肉中RAC和克伦特罗的同时分离检测，该方法对RAC的线性范围为0.8～29.6 ng/mL，LOD 达到0.0968 ng/mL，与2012年Feng建立的方法相比，灵敏度提高了数倍。

2.2.3 胶体金免疫层析法 近年来胶体金免疫层析法(Immune colloidal gold technique，GICT)发展迅速，使检测更加简单、快速、特异、灵敏，不需要借助相关仪器，检测效率能得到很大提高。其原理是胶体金标记的抗体与试纸条上的包被原或二抗在层析作用下发生特异性结合，从而使胶体金聚集形成肉眼可见的颜色。2009年Zhang等[32]建立了一种能同时快速检测猪尿中克伦特罗和RAC的胶体金侧流免疫分析法，仅需5 min即可通过颜色是否出现进行评价，在进行猪尿检测时，RAC的LOD及IC50分别为0.10±0.01 ng/mL和0.71±0.06 ng/mL。2011年蒋蔚等[33]通过柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，基于胶体金免疫层析法制备快速检测RAC的试纸条，用于检测猪尿时，该试纸条在8～10 min内完成测试，LOD为 5 ng/mL，与Zhang建立方法相比，耗费时间久，灵敏度相对来说较差。2013年Jiang等[34]建立了同时检测RAC与克伦特罗的胶体金免疫层析法，对RAC的 LOD为 2 ng/mL，需要时间为 5～8 min，此方法优于 2011年蒋蔚建立的方法，但与Zhang建立的免疫层析法的灵敏度相比较低，稳定性较好。

2.2.4 时间分辨荧光免疫分析方法 时间分辨荧光免疫分析方法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种非放射性标记免疫分析技术，以钐、铽、铕等三价稀土离子澜系元素为标记物，代替荧光物质、同位素、酶、化学发光物质标记抗体，用时间分辨荧光仪测定在抗原抗体发生特异性反应时产生特定的荧光，从而推断出抗原的浓度。2011年王超等[35]通过时间分辨荧光免疫分析方法，利用Eu3+标记RAC多克隆抗体，测定尿样中的RAC，LOD为0.05 ng/mL，相比于ELISA 检测方法，灵敏度更好，也有更高的稳定性。2017年李贞[36]建立了基于RAC-mAb的钐标记时间分辨荧光免疫分析方法，IC50与LOD分别为1.6 ng/mL和0.136 ng/mL，检测范围为0.39～12.77 ng/mL，此方法灵敏度优于化学发光法，也优于张祯等[37]建立的基于竞争双标记时间分辨荧光免疫分析法(LOD 为 0.25 ng/g)，但与王超的分析方法相比，灵敏度相对较低。2018年向露等[38]建立同时测定猪肉与牛肉组织中克伦特罗和RAC的纳米均相时间分辨荧光免疫分析方法，LOD为0.02 ng/mL，相比王超所用的时间分辨荧光免疫分析方法，不仅能同时检测克伦特罗和RAC，灵敏度也更优。RAC快速检测方法比较结果见表3。

表3 RAC快速检测方法比较Tab 3 Comparison of rapid RAC detection methods

2.3 生物传感器技术 免疫传感器是将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原抗体反应的生物传感器。表面等离子共振(Surface plasmon resonance, SPR)免疫传感器作为生物传感器的一种，以抗体为识别元件，将光敏管作为换能器的光学传感器，无需对样品进行标记、灵敏度高、能实时动态检测，已经广泛应用于制药、生命科学和生物化学的各个领域。2017年Wang[39]以RAC为检测对象，使用一抗开发了一种无标记的间接竞争性表面等离子体共振(SPR)免疫传感器，LOD为0.09 ng/mL，线性范围为0.3～32 ng/mL，此方法灵敏度、准确度都较高，并且在猪尿中回收率为101.8%～106.6%。2016年张媛媛等[40]以改性壳聚糖包埋固定羧基化多壁碳纳米管和菜克多巴肢抗体，构建新的免疫传感器用于RAC的检测，线性范围为0.05～4.05 ng/mL，LOD为0.08 ng/mL，并且对猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉样品进行检测，回收率为96.0%～102.0%，不仅灵敏度高而且准确度和精密度好。

2014年周妮等[41]成功的构建了RAC适配体电化学生物传感器，电化学适配体生物传感器是由固定了适配体的电极和电化学活性识别元素构成，该方法线性范围为0.5～100 ng/mL，LOD为0.1 ng/mL，反应时间为15 min，并且周妮对同一浓度的RAC利用该方法重复检测了7次，其峰电流值RSD值为3.8%，该方法有良好的重现性，但没有应用到实际样本中进行检测。

2017年He等[42]以壳聚糖为稳定剂，在等离子体辐照下合成了一种基于壳聚糖金纳米颗粒的电化学免疫传感器，电化学免疫传感器作为免疫传感器的一种是将免疫分析与电化学传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。其建立的方法检测RAC的LOD为2.27 pg/mL，检测范围为0.01～5 ng/mL，并且对猪尿进行了样品检测，回收率为93.0%～103.2%，稳定性好，灵敏度比其他检测方法高出近百倍，可用于痕量RAC的超灵敏检测。2020年Gu等[43]制备了GCE/GNP/RAC电化学免疫传感器，并在猪肉、猪脂肪及猪肝中进行RAC残留检测，检测范围为1～7000 ng/mL，回收率为87.6%～103.3%(RSD<14.6%)，LOD为0.1 ng/mL，该方法相比于上述方法检测范围广，并且可应用于多种基质。RAC生物传感器检测方法比较见表4。

表4 RAC生物传感器检测方法比较Tab 4 Comparison of RAC biosensor detection methods

3 小 结

如今，创新并完善RAC的检测方法来有效地监控其非法滥用，保障人民的食品安全是一项非常紧迫的任务。以上所述检测方法，在实际检测过程中可根据不同方法的优缺点以及预备应用地点，结合其长处来使用，不可完全互相取代，如使用免疫检测方法进行大量样品的现场初步筛查，再用超高效液相色谱-质谱法等仪器方法对初筛结果进一步确证。目前RAC较先进的检测方法，大多数与生物学结合，具有精确、灵敏、智能、新颖等优点，但此类方法多数操作难度大，专业性较强，成本较高，在实际操作中较难施展，可根据其现有方法优缺点对其加以修饰改进，突出方法的简便性、高效率、低成本与环保度，在实际应用中保证其检测结果，保障人们的饮食安全。