狂犬病毒G蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

张莹辉，朱 真，杜吉革，薛 麒，陈小云，冯 宇，印春生

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus,RV)引起的侵犯中枢神经系统的人畜共患传染病，发病后致死率几乎为100%[1]。RV入侵宿主后能够在宿主体内大量复制，进而转移至中枢神经系统而使其发病，狂犬病常见的临床症状包括神经兴奋、意识障碍等，最终全身麻痹死亡[2]。我国是受狂犬病危害较为严重的国家，其发病率仅次于印度，年均有2000～3000人因狂犬病死亡。该病在我国法定上报的传染病中位列前三[3]。

RV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)，是一种具有包膜的单链负股RNA病毒。它具有5种主要的结构蛋白，分别是核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、包膜糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L)。其中G蛋白位于病毒的囊膜外，是目前发现唯一可以刺激机体产生中和抗体的蛋白抗原[4-5]。通过基因重组表达的G蛋白可用于制备狂犬病亚单位疫苗，这在许多国家都已经有所应用。除此之外，G蛋白作为抗原还可以用于RV血清抗体的检测。

本研究拟采用pET-32a作为表达载体，使用大肠杆菌表达系统，对G蛋白进行优化表达，并对表达出的G蛋白进行纯化、鉴定，建立以G蛋白为抗原的间接ELISA方法，以期为RV血清抗体测定和单克隆抗体筛选提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料 RV CVS-11株由中国兽医药品监察所提供；pET-32a原核表达载体、Vero细胞均为本试验室保存；pMD-18T平末端载体、大肠杆菌JM109感受态细胞、DH5α感受态细胞和Rosetta(DE3)感受态细胞均购自TaKaRa公司。

1.2 主要试剂 Premix ExTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；XhoI和EcoR I DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国NEB公司；病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗均购自美国Sigma公司；HRP标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗犬IgG购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；IPTG、氨苄、卡那霉素购自天根生物有限公司。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 引物设计 根据GenBank中所提供RV的G蛋白基因序列(NCBI号：NC_001542.1)，使用Primer5软件设计上下游引物各一条，其中上游引物G-F/EcoR I序列为CGGAATTCATGGTT￣CCTCAGGTTCTTT，下游引物G-R/XhoI序列为CCCTCGAGTCACAGTCTGGTCTCGCC，其中斜体部分为保护碱基，下划线部分为酶切位点，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

1.3.2 总RNA提取及目的基因片段扩增 使用OMEGA病毒RNA提取试剂盒对RV细胞液进行总RNA提取，使用反转录试剂盒利用下游引物G-R/XhoI获得cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增目的片段：cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL、Premix ExTaq酶25 μL、双蒸水22 μL，混匀后94 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，32个循环，72 ℃ 10 min，扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定目的条带并进行胶回收。

1.3.3 目的基因测序鉴定 将胶回收后的目的片段连接到pMD-18T平末端载体上，得到pMD-18T-G并将其转化至JM109感受态细胞中，挑取菌落进行PCR鉴定，将鉴定连接成功的阳性克隆菌进行测序并扩增(测序由中美泰和生物技术公司完成)。

1.4 G蛋白的表达及纯化

1.4.1 表达载体的构建 将测序成功的目的基因用XhoI和EcoR I DNA限制性内切酶酶切后，使用T4DNA连接酶与同样进行双酶切的pET-32a载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α中，转化后使用含有氨苄西林的选择性LB琼脂培养基37 ℃过夜进行培养，挑取单菌落进行扩大培养并进行菌液PCR鉴定，对鉴定成功的菌液进行质粒提取，送至中美泰和生物技术公司测序。将测序正确的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经菌液PCR鉴定成功后将该质粒命名为pET-32a-RVG。将表达菌扩大培养后冻存于-80 ℃备用。

1.4.2 G蛋白的表达 将活化后的表达菌接种到10 mL含有Amp抗性的LB肉汤培养基中，37 ℃ 200 r/min 摇菌过夜，第2天以1%的比例接种于50 mL含有Amp抗性LB肉汤培养基中，37 ℃ 200 r/min，4 h后每隔30 min 取100 μL 菌液进行OD600nm测定，直到OD600nm值达到0.5～0.6，停止摇菌。取出1 mL菌液作为未诱导对照，再加入终浓度为1.0 mmol/L的诱导剂IPTG，在合适的诱导温度下继续培养，诱导结束后收集菌液，将未诱导和诱导后菌液均离心后弃去上清培养基，加入无菌PBS重悬沉淀，进行超声波裂解，直至溶液清亮，10000 r/min离心5 min，分别收集裂解后的沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.4.3 G蛋白的纯化及鉴定 将鉴定正确的包涵体蛋白进行SDS-PAGE电泳后，对所需的条带进行切胶回收，具体操作是将电泳后的蛋白胶浸泡在0.25 mmol/L的KCl溶液中约5 min，同时将蛋白Marker泳道和相邻蛋白样品泳道切下染色，观察胶块中的蛋白条带，并与Marker对照，将所需目的蛋白条带切下，用PBS清洗2次，将胶块在洁净密封袋中碾碎，加入一定量的PBS溶液，置于4 ℃冰箱中过夜，12000 r/min离心10 min，得到纯化后的G蛋白。对纯化后的蛋白使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度定量测定，并使用SDS-PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。

1.5 间接ELISA检测方法的建立

1.5.1 抗血清的制备 使用狂犬病国际标准疫苗以每次每只200 ng的量免疫10只Balb/c小鼠，共免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐剂对疫苗进行乳化，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫时使用弗氏不完全佐剂对疫苗进行乳化。从首次免疫后第一周开始，每两周收集一次小鼠血液，共收集5次，分离并混合血清，此血清作为阳性标准血清。同时取空白的Balb/c小鼠血清作为阴性标准血清。

1.5.2 间接ELISA方法建立 将纯化后的G蛋白作为抗原以不同的浓度包被于固相载体上，封闭后使用1.5.1中得到的阳性标准血清和阴性标准血清作为一抗与包被抗原结合，洗板去除未结合物，再加入HRP标记的羊抗鼠酶标抗体，最后通过加入能与酶反应的底物显色，通过读取OD450nm值进行定量判断。

1.5.2.1 抗原最佳包被量及一抗最佳稀释比例的确定 使用交叉实验的方法：将纯化后的G蛋白抗原按照1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng、7.8125 ng每孔的量包被到酶标板中，每孔100 μL；将阳性血清、阴性血清分别进行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍稀释，每孔100 μL。操作步骤按照常规间接ELISA方法进行。

1.5.2.2 酶标二抗稀释度优化 将HRP标记的羊抗鼠IgG酶标抗体用PBS进行1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000倍稀释。按照常规ELISA方法进行，根据试验结果确定酶标抗体的最佳使用浓度。

1.5.2.3 底物显色时间优化 使用TMB底物在室温下避光显色5、10、15和20 min。按照常规ELISA方法进行，根据试验结果确定显色时间。

1.5.2.4 封闭条件优化 分别使用1%脱脂乳、5%脱脂乳、1%BSA、5%BSA进行包被抗原的封闭，同时设置4 ℃ 封闭过夜、37 ℃ 封闭2 h的封闭条件，按照常规ELISA方法进行，根据结果确定试验最佳封闭条件。

1.5.3 间接ELISA方法阴阳性临界值、敏感性和特异性鉴定以及标准曲线的确定

1.5.3.1 阴阳性临界值的确定 使用此方法检测30份空白小鼠血清，计算血清OD450nm值的平均值和标准方差，并根据公式(阴阳性临界值=平均值+3×标准方差)计算阴阳临界值。

1.5.3.2 敏感性试验 按照1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000倍倍比稀释狂犬病病毒阳性血清，依次加入到包被好G蛋白抗原的ELISA板中，根据阴阳性临界值确定能够检测为阳性结果的稀释度，来确定方法的敏感性。

1.5.3.3 特异性试验 按照建立的间接ELISA方法，将狂犬病阴性血清和3份未免疫狂犬病疫苗小鼠的细小病毒阳性血清、3份犬瘟热病毒阳性血清进行检测，重复3次，根据待检血清和阴阳血清OD450nm值确定试验的特异性。

1.5.3.4 标准曲线的确定 使用FAVN法和犬的标准阳性血清对ELISA方法中小鼠标准阳性血清的效价进行测定，然后对小鼠标准阳性血清进行梯度稀释，测定其对应的OD450nm值，以OD450nm值为x轴、稀释度对应的阳性血清效价为y轴，绘制出表示两者线性关系的标准曲线。

1.5.4 方法与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法对比 使用已经建立的ELISA方法和FAVN方法分别对10份小鼠狂犬病阳性血清进行检测，分别计算出10份血清效价，比较两种方法的相关性。

2 结果与分析

2.1 G蛋白基因的扩增 以CVS-11株RV的cDNA为模版，用上下游引物进行扩增，扩增出G蛋白全长基因片段，大小为1575 bp(图1)，符合预期大小。

1: PCR product of G gene；M: DL2000 DNA Marker

2.2 G蛋白基因的克隆及鉴定 重组质粒pMD18-T-G经XhoI和EcoR I双酶切鉴定，得到1575 bp和2962 bp大小的两个片段(图2)，证明G蛋白基因已经正确克隆到T载体上。

M: DL5000 DNA Marker；1: PCR product of G gene; 2: Double enzyme digestion product of pMD18-T-G

2.3 重组表达质粒pET-32a-G的构建及鉴定 用XhoI和EcoR I对目的片段进行双酶切后连接于酶切后的pET-32a载体上，对质粒进行双酶切鉴定，得到1575 bp和5900 bp大小的两个片段(图3)，鉴定正确后送测序，测序结果正确。pET-32a-G构建成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1: PCR product of G gene；2: Double enzyme digestion product of pET-32a-G

2.4 重组表达蛋白SDS-PAGE鉴定及其可溶性分析 重组菌经诱导表达后，在62 kD附近出现目的条带(图4)，且多存在于包涵体沉淀中，表明蛋白以包涵体形式存在。

M: Protein Marker；1: Supernatant of pET-32a-G；2: Inclusion bodies of pET-32a-G

2.5 重组表达蛋白的纯化及其鉴定 对切胶纯化后的G蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定，结果显示纯化后的蛋白无杂蛋白，纯度较高(图5、图6)。

M: Protein Marker; 1: Purified protein; 2:Inclusion bodies

M: Protein Marker; 1-3: purified protein

2.6 间接ELISA最佳工作条件的确定 根据正交实验结果，当G蛋白抗原包被量为7.8125 ng/孔、血清稀释度为1∶100时，阳性血清接近1.0，此时阳、阴性血清OD450nm比值(P/N)最大。因此选择1∶100为最佳的阴阳性血清稀释度，7.8125 ng/孔为最佳的抗原包被量。使用4种封闭液分别封闭抗原，间接ELISA方法测定封闭效果，使用5%BSA作为封闭液时，阳性血清OD450nm值在1附近，且阳性、阴性血清OD450nm比值最高，故5%BSA为最佳封闭液。将HRP标记的羊抗鼠IgG抗体进行1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000倍稀释，按照间接ELISA方法测定阴阳性血清的OD450nm以及P/N值，酶标二抗的最佳稀释浓度为1∶8000。使用TMB底物显色液在避光条件下进行ELISA试验，分别在不同的时间终止显色，测定阴阳性血清OD450nm值，确定底物显色时间为室温下避光15 min。对已知的30份狂犬病病毒抗体阴性血清进行检测，计算OD450nm平均值为0.1648，标准差为0.0313,因此阴阳性临界值为0.2587。

2.7 ELISA方法敏感性试验 使用本试验建立的ELISA方法对不同稀释倍数的阳性血清样品进行敏感性检测。如表1所示，当血清在1∶16000倍稀释时，其OD450nm大于阴阳性临界值，且P/N值大于2。

表1 间接ELISA检测方法敏感性分析

2.8 ELISA方法特异性试验 用间接ELISA方法检测犬细小病毒小鼠阳性血清和犬瘟热病毒小鼠阳性血清，同时设置狂犬病病毒阳性血清、阴性血清和空白对照，试验结果如表2所示，犬细小、犬瘟热病毒以及空白小鼠血清OD450nm平均值均在阴阳性临界值之下，说明ELISA方法特异性较好。

表2 间接ELISA方法的特异性分析

2.9 ELISA方法标准曲线方程 使用ELISA方法以及已知效价的小鼠狂犬病阳性血清进行试验，如表3所示，以ELISA方法检测的血清中和抗体OD450nm值作为x轴，以已知的中和抗体滴度作为y轴，建立计算抗体滴度的标准曲线方程(图7)，得出多项式方程y=0.839x2-1.1798x+0.51，其相关系数为0.98，接近1，表明两者的相关性较好。

表3 不同中和抗体滴度对应的OD450nm值

图7 不同中和抗体滴度对应的OD450nm值标准曲线

2.10 ELISA与FAVN试验结果比较 本试验中狂犬病病毒感染Vero细胞荧光照片如图8。当孔内出现类似如图所示的细胞内荧光显影时，即可将该孔判定为阳性，未出现细胞内荧光显影，可判定为阴性，如图9。

图8 CVS-11感染Vero细胞荧光图

图9 未被病毒感染Vero细胞荧光图

使用ELISA和FAVN方法检测10份阳性血清样品，分别计算其抗体含量，如表4所示，将两者的结果变化趋势以折线图表示(图10)，计算两条折线的相关系数为0.986。两种方法检测10份血清的阳性率均为100%，表明本试验建立的ELISA方法与OIE推荐的FAVN法检测小鼠血清抗体效价具有较非常高的符合率。

表4 FAVN法和ELISA检测10份血清样品的抗体含量

图10 ELISA和FAVN法检测10份血清样品中和抗体含量结果比较

3 讨 论

狂犬病严重危害着人类和动物的健康，我国是受其影响最严重的国家之一。目前针对人类的狂犬病，预防性接种和暴露后的接种是防治狂犬病的主要措施。狂犬病疫苗的使用效果需要通过免疫后的抗体效价监测来实现，目前WHO推荐的抗体监测方法为FAVN法，这种方法在试验过程中需要使用CVS-24毒株，存在一定的危险性[6]。而ELISA方法具有灵敏度高、快速、操作便捷、成本低的优点，除使用全病毒粒子之外，使用具有特异性抗体识别位点的G蛋白进行抗体的检测也具有一定的可行性[7]。RV中G蛋白的基因全长为1575 bp，由524个氨基酸组成，G蛋白与病毒的致病力有密切的关系，并且能够诱导细胞免疫，刺激机体产生对抗病毒的中和抗体。G蛋白是一种跨膜蛋白，具有三聚体结构，位于狂犬病病毒包膜和感染细胞的质膜中，包含胞质内区域，疏水性跨膜区域和胞外区域，三种单体的结合形成了三聚体[8]。研究表明G蛋白具有3个中和抗体结合位点，其中III号位点最为重要，是位于330～357位氨基酸序列，G蛋白变性后，III号位点随即消失，但除此之外，G蛋白还含有一些线性表位，这些表位不依赖于高级空间结构也能够存在，在变性的蛋白中能够存在，从而能够被抗体特异性识别。

本研究以原核系统表达的G蛋白作为包被原，使用免疫了狂犬病标准疫苗的小鼠血清作为阳性血清，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗，摸索各个试验环节的最佳条件，最终建立了间接ELISA方法，可以用于检测小鼠血清样品中狂犬病病毒中和抗体的水平，也可以用于狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体制备过程中，抗狂犬病病毒G蛋白抗体阳性杂交瘤细胞的筛选。本方法的特异性好，与常见的能够感染犬只的犬细小病毒和犬瘟热病毒均无交叉反应；本方法的敏感性高，在血清稀释度为1∶16000时仍然能够检测出阳性，这也说明虽然试验使用的包被抗原以包涵体形式存在，但其主要的抗原抗体结合位点并未受到空间构象的影响。

FAVN法具有很好的灵敏度和准确性，其结果在判定时较荧光灶试验受主观因素影响小，且试验周期较短，是广泛使用的抗体效价检测方法，也是国际公认的检测狂犬病病毒中和抗体的金方法之一[9-10]。使用荧光抗体病毒中和试验与本试验建立的ELISA方法同时检测10份小鼠血清，结果表明两种检测方法得出的结果相关性较好，阳性符合率为100%。进一步说明本试验建立的ELISA检测方法结果可靠。ELISA方法具有简便、快速、灵敏度高等优点，且对试验条件的要求低，相比于FAVN法，具有不用活毒、试验周期短、可检测样本量大等优点。因此ELISA方法更适用于疫苗效力检验中免疫小鼠血清中和抗体的测定。

本试验中使用G蛋白作为包被原建立的ELISA方法可用于检测小鼠血清抗体含量，也可用于狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体制备过程中的阳性杂交瘤细胞筛选，当把本ELISA方法中辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体换作抗犬的抗体之后，经过优化试验条件，也可用于犬血清中狂犬病病毒中和抗体的检测，对疫苗免疫后的犬体内抗体含量变化情况进行监测，来评价疫苗的免疫效果[11]。