HPLC法测定二氧化氯乳头消毒剂中乳酸的含量

王欢欢，刘 静，张靖菊，徐 飞

(国家饲料药物基准实验室，中国农业科学院饲料研究所，北京100081)

乳酸是一种天然的有机酸，是重要的抗菌化合物[1]，属于消毒防腐类药，是公认安全的GRAS(Generally recognized as safe，GRAS)添加剂[2]，广泛应用于饮食业、化妆品业、医药业和畜牧业等行业中[3]。乳酸主要有三种构型[4]，分为D型、L型和DL型，由于D-乳酸、DL-乳酸对人体有一定的毒副作用，所以与饮食业相关的乳酸构型为L型。乳酸能抑制真菌的生长[5]，有助于农副产品的保存。有研究表明[6-8]，乳酸对部分革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌和部分真菌都有杀灭和抑制作用，其对致病菌主要是通过延长代时和破坏正常细胞膜电位来达到抑菌及杀菌作用[9]。乳酸作为原料药收录于2020版《中国药典》中[10]，与水溶液显酸性，含量测定方法为滴定法，范围为85%～92%(g/g)。文献报导的乳酸的含量测定方法有高效液相色谱法[11]、液质联用技术[12]、离子色谱法[13]、气相色谱法[14]等。液质联用技术、离子色谱法和气相色谱法测定乳酸均具有局限性，与高效液相色谱法相比操作复杂且成本较高。乳酸具有热不稳定性，在高温下易分解[15]，用气相色谱法测定时，需将极性强的乳酸衍生化为极性弱的酯化物[16]，处理过程较为复杂且耗时较长。本文拟建立HPLC法测定二氧化氯乳头消毒剂中乳酸的含量，并对其色谱条件进行耐用性试验，验证其可靠性，可作为该乳头消毒剂中乳酸的含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪(Waters 2695，配2487紫外检测器)，美国Waters公司；超纯水一体化系统，美国Pall公司；电子天平(万分之一)，德国Sartorius公司；针式过滤器(有机系)(0.22 μm)，天津市津腾实验设备有限公司；微孔过滤膜(有机系)(0.22 μm)，美国Waters公司；二氧化氯乳头消毒剂(其中乳酸含量2.4%)，中国农业科学院饲料研究所国家饲料药物基准实验室自主研发；乳酸原料药(含量85%)，国药集团化学试剂有限公司；乳酸对照品(含量89.9%)，德国Ehrenstorfer GmbH公司；磷酸为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈为色谱级纯，美国Fisher公司。

1.2 色谱条件 色谱柱：资生堂Capcell Pak C18MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸水溶液-乙腈=97.5∶2.5，V/V；检测波长：215 nm；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

1.3 溶液配制 对照品溶液的配制：精密称取乳酸对照品适量，加水溶解并稀释制成质量浓度为10 mg/mL的溶液，作为对照品储备液。精密移取乳酸对照品储备液适量，加水稀释制成500 μg/mL的乳酸溶液，作为对照品工作液。

供试品溶液的配制：取充分混匀后的本品适量(约相当于乳酸50 mg)，精密称量，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度线，振荡提取1 min。精密移取1 mL提取液置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品工作液溶液。

1.4 方法参数考察和耐用性试验 参照2015版《中国兽药典》附录0512，对系统适应性、线性、灵敏度、精密度、准确度、溶液稳定性及方法耐用性试验进行了考察和研究。

2 结果与分析

2.1 系统适应性 如图1所示，对照品和供试品乳酸保留时间分别为4.313和4.318 min，对照品工作液中乳酸主成分峰与相邻色谱峰完全分离，USP拖尾因子为1.05，USP理论塔板数为18739，连续进样6针后，主峰峰面积RSD为0.35%，小于2%，符合标准。

图1 色谱图(500 μg/mL乳酸对照品(A)；500 μg/mL乳酸供试品(B)；空白辅料(C)；空白辅料-500 μg/mL乳酸对照品(D))

2.2 线性关系考察 精密移取对照品储备液适量，用水稀释成200、400、500、600、800、1000 μg/mL的系列浓度溶液，按1.2项下色谱条件进样，以浓度为横坐标，乳酸峰面积为纵坐标，得出标准曲线回归方程为：Y=536X+3280，决定系数R2=0.9999，显示该方法的线性良好。乳酸标准曲线如图2所示。

图2 乳酸峰面积-浓度标准曲线图

2.3 灵敏度 采用逐步稀释的方法，按信噪比S/N≥3，得出检测限为5 μg/mL；按信噪比S/N≥10，得出定量限为13 μg/mL。

2.4 精密度

2.4.1 重复性 供试品工作液(500 μg/mL)按照1.2项下色谱条件连续进样6次，计算主峰峰面积相对标准偏差(RSD)。结果表示，RSD为0.11%，重复性良好。

2.4.2 方法精密度 配制6份供试品工作液(500 μg/mL)按照1.2项下色谱条件进样，计算主峰峰面积RSD。结果表明，RSD为0.23%，方法精密度良好。

2.4.3 中间精密度 同一人员，不同时间另配制6份供试品工作液(500 μg/mL)，按照1.2项下色谱条件进样，计算主峰峰面积RSD，以及与方法精密度平均结果的相对偏差(RD)。结果表明，中间精密度主峰峰面积RSD为0.14%，与方法精密度平均结果的相对偏差为0.17%，小于2.0 %，该方法重现性良好。

2.5 准确度 空白辅料中分别加入乳酸对照品318.35、265.45、212.56 mg各三份，制成高、中、低三个浓度(120%、100%、80%)的样品。分别取充分混匀后的上述样品适量，按1.3项条件下配制为供试品工作液，按照1.2项下色谱条件进样检测，另取乳酸对照品工作液(500 μg/mL)进样检测。记录峰面积并计算回收率及RSD。结果如表1所示，平均回收率为98.50%，RSD为0.32%，准确度良好。

表1 乳酸准确度(回收率)试验结果

2.6 溶液稳定性试验 供试品工作液(500 μg/mL)室温条件下放置24 h，分别于0、2、4、6、8、10、24 h按照1.2项下色谱条件进行测定，计算放置不同时间下乳酸的含量并与0 h初始值峰面积比较。结果表明，放置24 h后峰面积为初始值的100.02%，乳酸含量RSD为0.09%，表明该溶液在24 h以内具有很好的稳定性。

2.7 耐用性

2.7.1 检测波长考察 取供试品工作液及对照品工作液(500 μg/mL)适量，考察在210～220 nm范围内不同检测波长对乳酸含量测定的影响。结果表明，主成分乳酸含量RSD为0.11%，表明在检测波长在210～220 nm之间样品中主成分乳酸的含量能准确测定。

2.7.2 检测流速的考察 取供试品工作液及对照品工作液(500 μg/mL)适量，考察0.8～1.2 mL/min范围内不同检测流速对乳酸含量测定的影响。结果表示，主成分乳酸含量RSD为0.07%，表明在检测流速在0.8～1.2 mL/min之间样品中主成分乳酸的含量能准确测定。

2.7.3 检测柱温的考察 取供试品工作液及对照品工作液(500 μg/mL)适量，考察30～40 ℃范围内不同检测柱温对乳酸含量测定的影响。结果表示，主成分乳酸含量RSD为0.40%，表明在检测柱温30～40 ℃之间样品中主成分乳酸的含量能准确测定。

2.7.4 不同流动相组成比例的考察 取供试品工作液及对照品工作液(500 μg/mL)适量，考察不同流动相组成比例(表2)对乳酸含量测定的影响。结果表示，主成分乳酸含量RSD为0.34%，表明在此5组不同流动相比例样品中主成分乳酸的含量能准确测定。

表2 五组不同流动相比例

2.7.5 不同色谱柱的考察 取供试品工作液及对照品工作液(500 μg/mL)适量，考察相同类型不同品牌的色谱柱(表3)对乳酸含量测定的影响。结果显示，主成分乳酸含量RSD为0.51%，表明使用相同类型不同品牌的色谱柱样品中主成分乳酸的含量能准确测定。

表3 三根不同色谱柱

2.8 样品含量测定 取二氧化氯乳头消毒剂五批(YL200507、YL200512、YL200515、YL211020、YL211021)，按1.3项条件下配制为供试品工作液，按照1.2项条件下色谱进行检测，五批样品的含量分别为102.38%、103.95%、104.43%、100.94%、100.09%。

3 讨论与结论

3.1 样品前处理的优化 二氧化氯乳头消毒剂为本实验室自主研发，用于挤奶后消毒的消毒产品，分为A剂(主要成分为乳酸)和B剂(主要成分为亚氯酸钠)两部分，使用时两部分混合，亚氯酸钠和乳酸发生歧化反应产生的二氧化氯为消毒作用的主要成分。为达到持续消毒的效果，本产品中含有增稠剂、稳定剂和着色剂等辅料，滴定法等方法既无法测定A剂中辅料是否对乳酸含量有影响也无法测定混合后产品中乳酸的余量。

对二氧化氯乳头消毒剂样品进行前处理，主要目的是排除增稠剂、稳定剂和着色剂等辅料对检测结果的影响。样品用超纯水稀释提取后，工作液浑浊，不易过0.22 μm的滤膜，需多次过滤，上机检测时，主峰与杂质峰分离度较差，且杂质峰过多。样品用乙腈和乙醇提取时，主峰峰型分叉。样品用甲醇提取时，提取液易过膜，主峰响应高且与杂质峰完全分离，故选用甲醇作为提取液。由于甲醇中有羟基，微量乳酸与之反应，乳酸在水溶液中稳定性好，样品用甲醇提取后加水稀释为供试品工作液，此溶液在24 h内稳定。

3.2 色谱条件的选择 根据相关文献报道[15]及全波长(210～400 nm)扫描结果，乳酸的响应随着波长增大而减弱，在215 nm处有良好的吸收且峰型及分离度较好，故选用215 nm作为检测波长。根据已经发表的文献[17-20]，流动相中水相相比有机相所占比例较大，大部分流动相都是含盐流动相，此类流动相易堵塞仪器，需要耗费时间维护仪器，故选用不含缓冲盐的流动相。流动相分别考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水等，结果以乙腈-0.1%磷酸水为流动相时，乳酸峰型及分离度最好。分别对表3中的三根色谱柱进行考察，含量测定选用乳酸峰型及分离度最好的色谱柱，即Capcell Pak C18MG色谱柱。

本文建立了HPLC法测定二氧化氯乳头消毒剂中乳酸的含量方法，该方法线性关系良好，精密度高，准确度良好，溶液稳定性和耐用性好，且操作简便、可靠性好，可以用作该乳头消毒剂中乳酸的质量控制。