液相色谱-串联质谱法测定猪肉中四环素类药物残留量的不确定度评定

武 煊，李小桥，邹 锐*

(1.农业农村部畜禽产品质量安全监督检验测试中心(重庆)，重庆 401120；2.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 401120)

测定不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性，是测量结果质量的指标。不确定度越小，所得到的测量结果与被测量的真值越接近。实验室在出具检测报告和认可考核中都会涉及检测结果不确定度的评定，ISO17025-2017《校准和检测实验室能力的通用性要求》明确要求“当不确定度与检测结果有效性或应用有关，或客户的指令中有要求，或不确定度影响到限度的符合性时，检测报告中需包括有关不确定度的信息”[1]。

四环素类药物主要包括土霉素、四环素、金霉素和强力霉素等[2]，是目前全球范围内使用广泛的一类抗生素[3-5]。现在主要采用高效液相色谱法[6-7]和液相色谱-串联质谱法[8-9]对其残留量进行检测，对其不确定度的研究也多见报道[10-15]，但目前尚未见采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对猪肉中四环素类药物进行不确定度评定的报道。

采用GB/T 21317-2007的检测方法，依据CNAS-GL 006-2019《化学分析中不确定度的评估指南》[16]和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[17]要求，采用LC-MS/MS对猪肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量的不确定度进行分析与评定，旨在提高检验结果的可靠性，为实验室的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪 AB 5500Q(美国 ABI SCIEX公司)；电子分析天平 XP205(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

对照品购买自德国Dr.Ehenrnstorfer公司，盐酸土霉素，含量：96.02%，不确定度：0.19%；盐酸四环素，含量：97.15%，不确定度：0.18%；盐酸金霉素，含量：92.5%，不确定度：5.0%；盐酸强力霉素，含量：99.3%，不确定度：2.0%。

Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美国Waters公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，德国 Merck公司)；其它试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取猪肉试样5 g(精确至 0.01 g)于 50 mL离心管中，加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲液20 mL，振荡10 min，10000 rpm离心，取上清液，重复提取一次。合并两次提取液，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine定容于50.00 mL容量瓶中。过滤，吸取10.0 mL提取液转移至 HLB固相萃取柱中(使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水进行活化)，提取液流干后分别用 5 mL水和 5 mL 5%甲醇水进行淋洗，抽干后用 10 mL甲醇-乙酸乙酯(1+9)(V/V)洗脱，洗脱液用氮吹至干，用1.0 mL 10%甲醇溶液溶解残渣，用0.22 μm有机相滤膜过滤，供LC-MS/MS测定。

1.2.2 标准溶液的配制 准确称取盐酸土霉素 27.65 mg，盐酸四环素27.93 mg，盐酸金霉素28.62 mg，盐酸强力霉素26.19 mg于4个 25 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，作为四环素标准贮备液。精确吸取各标准储备液1.0 mL于同一100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，得到标准工作液。再用10%甲醇稀释，得到各组分浓度分别约为10、20、50、100、200 ng/mL的对照溶液，供测试用。

1.2.3 仪器条件 色谱柱：Agilent C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，1.7 μm)；流速为0.25 mL/min；柱温为30 ℃；进样量：5 μL；流动相梯度洗脱程序见表2。

表3 多反应监测条件

1.2.4 回收率的计算 采用加标回收的方式，称取5份质量均为5.00 g的猪肉空白样品，添加四环素类药物工作液0.025 mL，制备成加标水平约为50 μg/kg的阳性添加样品。按1.2.1的过程进行前处理后，按1.2.3的仪器条件进行检测，计算回收率。

2 数学模型的建立

猪肉中四环素类药物残留量计算公式：

式中：X：供试品中待测组分的含量，μg/kg；

m：供试品称样量，g；

A：供试品相应目标化合物的峰面积；

As：标准溶液中相应目标化合物的峰面积；

Cs：标准溶液中相应目标化合物的浓度，ng/mL；

V1：提取液总体积，mL；

V2：过HLB固相萃取柱的提取液体积，mL；

V3：最终定容体积，mL。

3 不确定度来源分析

根据检测方法以及数学模型，猪肉中四环素类兽药残留量不确定度分量主要来源有：

Urel(1)：样品称量引入的不确定度；

Urel(2)：样品定容引入的不确定度；

Urel(3)：标准物质引入的不确定度；

Urel(4)：回收率引入的不确定度；

Urel(5)：测试过程中随机效应引入的不确定度。

4 不确定度分量的评定

4.2 样品定容引入的不确定度

4.2.1 容量瓶和移液管刻度引入的不确定度 依据JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[18]，A级50 mL容量瓶、10 mL移液管、1 mL刻度移液管的最大允许误差分别为±0.05、±0.020、±0.008 mL，按矩形分布，k=3，则50 mL容量瓶、10 mL移液管、1 mL刻度移液管分别引入的标准不确定度为：

容量瓶和移液管引入的相对标准不确定度为：

U(2.4)=

4.2.2 温度引入的不确定度 玻璃仪器的校准温度为20 ℃，实验室的实际温度范围为20 ℃±3 ℃，水在此温度下的膨胀系数为1.80×10-3，假设温度变化按矩形分布，k=3，50 mL容量瓶、10 mL移液管和1 mL刻度移液管的标准不确定度分别为：

温度变化引入的相对标准不确定度为：

U(2.8)=

样品定容引入的相对标准不确定度为：

4.3 标准物质引入的不确定度

表4 标准物质纯度的相对标准不确定度

则移液管的相对合成标准不确定度为：

4.3.5 标准工作曲线配制引入的不确定度 分别移取 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL标准中间液到100 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液定容，得到标准工作液曲线。标准工作液曲线的相对合成标准不确定度见表5。

表5 配制标准工作曲线溶液引入的不确定度

4.3.6 标准曲线拟合引入的不确定度 对标准工作溶液的5个点分别测定1次，得到相应的色谱峰面积，采用最小二乘法进行拟合，得到土霉素、四环素、金霉素、强力环素的回归曲线方程。得到各组分的线性回归方程及回归系数分别为：土霉素：y=0.8434x+3.4863，R2=0.9996；四环素：y=1.0153x+0.2832，R2=0.9993；金霉素：y=1.0142x+0.5395，R2=0.9991；强力霉素：y=1.013x-0.1466，R2=0.9997。计算标准曲线的残差标准差(见表6)：

其中：n：标准曲线浓度点数，n=5；

yi：浓度为xi所对应的实测峰面积；

计算标准工作曲线拟合引入的不确定度(表6)：

表6 标准曲线的不确定度

其中：s：标准曲线的残差标准差；

b：标准曲线的截距；

n：参与校准曲线拟合的浓度点的个数，n=5；

p：阳性添加样品测定次数，p=5；

xi：校准曲线各点的浓度, ng/mL；

对上述标准物质的各分量不确定度进行合成，得到相对合成标准不确定度(表7)。

表7 标准物质的相对合成标准不确定度

4.4 回收率引入的不确定度评价 样品前处理方法较为复杂，包括提取、净化、洗脱、浓缩等过程，本实验的回收率采用1.2.4的方法制备5份阳性添加平行样品，测得各组分的回收率。考虑平均回收率引入的不确定度(表8)。

表8 回收率引入的不确定度

Sr：回收率标准偏差

对回收率采用t检验进行显著性分析，以确定检测结果是否需要进行回收率校正(表8)。当自由度f=4时，查t临界分布表，t(0.05，4)=2.776。据表8可知，各组份t检验结果分别为：土霉素t=0.007<2.776，四环素t=0.050<2.776，金霉素t=0.134<2.776，强力霉素t=0.081<2.776，故回收率无显著性差异，不必用回收率校正结果。

4.5 随机效应引入的不确定度 对加标样品重复性测定5次，计算随机效应引入的相对不确定度(表8)。

S：阳性添加样品添加量测定值标准偏差

5 合成标准不确定度评定

由上述各相对不确定度合成猪肉中四环素类兽药残留量的相对标准不确定度；取包含因子K=2，计算扩展不确定度(置信概率为95%时包含因子)(表9)：

表9 相对标准不确定度

U=K×Urel

液相色谱-串联质谱仪测定猪肉中四环素类兽药残留结果表示为：土霉素(50.05±5.44)μg/kg、四环素(42.81±6.72)μg/kg、金霉素(42.45±2.86)μg/kg、强力霉素(41.60±4.80)μg/kg。

6 结 论

液相色谱-串联质谱法测定猪肉中4种四环素类兽药残留的不确定度主要来源按影响大小主要来源于回收率、标准物质和随机效应。因此，在实际检测工作中可以通过制定实验室SOP来规范不同检测人员的操作过程，选择精度更高的玻璃仪器进行标准溶液的配制，减少随机误差来提高检测结果的准确性。