抗胞内菌感染纳米药物研究进展

苏楠楠，董 贵，刘金环，王梦华，尹梦丽,罗万和，陈 伟

(新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室/ 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300)

兼性或专性胞内菌感染给畜牧业带来严重经济损失[1]。因胞内寄生菌可在宿主细胞中定植并长期生存，不仅能通过许多巧妙的机制抵御宿主的防御系统，而且还会随着宿主细胞的游走而在机体内扩散，导致持续性、潜在性和复发性的感染[1-2]。因此，兼性胞内菌[(金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus,S.aureus)、沙门菌(Salmonella)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)、单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)、布鲁氏菌(Brucella)]和专性胞内菌[胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis, LI)]感染的治疗在兽医临床上面临着巨大的挑战。如由胞内S.aureus所引起的奶牛乳房炎，因常规抗菌药物难以进入宿主细胞中，导致其治愈率不高[3]。加上抗菌药物的不合理使用，已导致多重耐药(multidrug resistance, MDR)菌株的产生[3]，给奶牛乳房炎的防治工作增添了难度。因此，迫切需要新的策略来治疗胞内S.aureus的感染。

目前，设计和研发新型的抗菌药物和新的抗菌药物递送系统被认为是治疗胞内菌感染的一种有效方法[4]。但是设计和研发一种新型的抗菌药物耗时长，花费巨大，投入精力大，给科研单位和工作人员带来了一定的困难。纳米技术通过将抗菌药物制成纳米粒，经淋巴转运和炎性部位毛细血管的渗透作用输送到感染的靶部位或靶细胞，从而提高胞内药物浓度和延长有效胞内停留时间，改善抗菌药物递送系统，以此提高胞内菌感染的治疗效果[5]。

本文通过归纳和总结常见兼性或专性胞内菌的特性以及纳米抗菌药物治疗胞内菌感染的现状，讨论并分析纳米抗菌药物在治疗胞内菌感染所面临的挑战，并提出相应展望，为进一步深化纳米抗菌药物胞内转运机制研究，提高抗胞内菌感染效果提供理论基础。

1 胞内菌感染

由兼性和专性胞内菌所引起的感染，其感染机制和临床常用药物如表1所示。

表1 兼性和专性胞内菌的感染机制和常用药物Tab 1 Infection mechanism and common drugs of facultative and specific intracellular bacteria

1.1 兼性胞内菌

1.1.1 胞内S.aureus据报道，在美国和日本，每头奶牛每年因乳房炎造成的经济损失分别高达161美元和5万日元，其中日本隐性乳房炎患牛产奶量约降15%，而临床型乳房炎患牛的产奶量可下降40%。我国奶牛临床型乳房炎的平均发病率为33.14%，而隐性奶牛乳房炎的阳性率高达73.91%。

S.aureus作为一种常见的兼性胞内菌，以一种小菌落变异体(Small Colony Variants, SCVs)的方式，在细胞内持续存在[6]。研究表明，当S.aureus由正常状态变为SCVs时，更易入侵宿主细胞，在细胞内形成细菌贮源地后，可巧妙地抵御胞内防御体系[11]。且由于SCVs持续存在于细胞内，可能会导致长期和反复感染，且SCVs的出现与奶牛乳腺炎的亚临床感染和反复感染密切相关[6]。当S.aureus入侵奶牛乳房后，可粘附并定植于乳腺上皮细胞中，完全游离于细胞质中，吸取细胞质中的营养，以供自己繁殖生存[6]。

目前，在兽医临床上治疗S.aureus感染的抗菌药物有头孢洛宁、利福昔明、氨苄青霉素、硫酸头孢喹肟。其中薛梅等[7]采用头孢洛宁和利福昔明乳房注入剂治疗干乳期奶牛乳房炎，治愈率为87.23%和85.29%。马志明等[8]采用氨苄青霉素治疗早期临床型乳房炎，治愈率为43.75%。魏占勇等[9]采用硫酸头孢喹肟乳房注入剂治疗干乳期奶牛乳房炎，其治愈率为66.7%。这些抗菌药物对治疗奶牛乳腺炎虽具有较高的治愈率，但由于细胞膜的生物屏障作用，抗菌药物难以在胞内感染靶位达到有效的治疗浓度和时间。其次抗菌药物对S.aureus毒力因子的作用欠佳，且在抗菌药物反复的刺激作用下，细菌会释放更多毒素，加重感染[10]。同时，多重耐药现象的产生也使胞内S.aureus感染的治疗面临着更大的挑战。

1.1.2 胞内Salmonella由胞内Salmonella引起的鸡白痢，可导致鸡的受精率和产蛋率下降[11]。据报道，鸡白痢在我国发病率为20%～40%，致死率为10%～60%[12]。同时，Salmonella在食品生产中的高检出率，给食品安全和公共卫生造成了重大隐患，并引起了广泛关注。Salmonella感染动物后，主要侵袭于肠粘膜淋巴上皮细胞或肠上皮细胞，引发炎症。且在毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统(tyre three secretion system, TTSS)的调控下，在囊泡内大量繁殖生存，以此来躲避宿主免疫系统的识别与攻击，并在宿主细胞内释放多种毒力因子，引发严重感染[13]。目前，在兽医临床上常用氟苯尼考、卡那霉素、土霉素和呋喃唑酮等抗菌药物来治疗Salmonella感染。刘立军等[14]用氟苯尼考、卡那霉素、土霉素和呋喃唑酮等药物治疗鸡Salmonella病，其治愈率分别为91.7%、85%、80%和53.3%。这些抗菌药物虽在体外对Salmonella均有一定的效果，但难以跨细胞扩散，因而在体内不能有效治疗胞内Salmonella感染。因此，在选择有效抗菌药物的基础上，急需设计和研发新型抗菌药物递送系统，提高胞内药物浓度和延长有效时间，改善纳米药物胞内转运能力，从而提高治疗胞内Salmonella感染的效果。

1.1.3 胞内M.tb由M.tb引起的结核病是世界危害最大的人兽共患传染病之一[15]。全球每年约有5000万的牛感染M.tb，每年造成约30亿美元的损失[16]。M.tb通过感染吞噬细胞，在胞内分泌毒力因子并抑制机体免疫机制，造成细胞内持续性感染[17]。Monika等[18]通过4种药物(链霉素、异烟胼、利福平、乙胺丁醇)对134株M.tb分离菌株的药敏试验检测其敏感性，结果表明M.tb对4种抗菌药物均敏感。但因牛结核病的治疗费用高，且不易根治，故目前在兽医临床上对于牛结核病以预防为主[18]。李少晗等[19]所开发的新型检测奶牛结核病技术，可为防控和净化牛结核病提供帮助。孙娅莉[20]认为养殖场应坚持自繁自养的原则，落实检疫与消毒管理等防治策略，可起到净化结核病的效果。

1.1.4 胞内LM 经口感染后的LM在黏附毒力因子(内化素)的作用下，入侵宿主肠上皮细胞，并分泌α-溶血素，介导其从吞噬体中逃逸进入到宿主细胞的胞浆内。通过掠夺宿主细胞的营养物质，进行增殖分化，引起全身性感染[21]。目前，常用克林霉素、青霉素、四环素、氯霉素等抗菌药物测定其敏感性。Garedewd等[22]从埃塞俄比亚食品中分离得到LM对青霉素、四环素和氯霉素的耐药率分别为66.7%、37.5%和16.6%。Gómez等[23]从西班牙肉产品中分离得到的LM对克林霉素和四环素分别耐药率为35.0%和0.5%。由此可见，LM对以上抗菌药物均表现出不同程度的耐药性。

1.1.5 胞内Brucella由Brucella引起的布病是畜牧业中危害严重的疾病之一。近些年来，布病阳性率逐年升高，如羊发病率为0.26%～4.11%，牛发病率为0.51%～1.78%。同时Brucella通过污染肉和乳制品而间接性导致布病发病率为11.5%。Brucella可在吞噬细胞和上皮细胞内大量繁殖后，随着血液的流动，并分泌多种毒力因子，到达内脏器官，引发感染[24]。Brucella主要通过消化道、黏膜、呼吸道等途径进入到宿主内，黏附于吞噬细胞。且Brucella细胞膜上的多糖可抑制吞噬细胞的凋亡，实现免疫逃逸，并在宿主细胞内掠夺营养大量繁殖生存，Brucella所释放内毒素与多种毒力因子可引发菌血症，严重时会形成脓毒血症，致使宿主死亡。该菌也可通过感染上皮细胞，释放纤维素性脓性分泌物，导致母畜流产[25]。目前，在兽医临床上对待布病主要以预防为主，因为长时间的使用抗菌药物会增加耐药率，且治疗成本过高，会给畜牧业的发展和经济带来一定的损失[26-27]。

1.2 专性胞内菌 作为专性胞内寄生菌的LI能在猪肠道细胞内大量繁殖，引起一种以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠上皮细胞发生腺瘤样增生为特征的猪增生性肠炎(Porcine Proliferative Enteropathy, PPE)，其感染潜伏期长，一般为2～3周[28]。在兽医临床上主要采用氧氟沙星、泰妙菌素等抗菌药物治疗PPE。肖和良等[29]采用注射氧氟沙星注射液和泰妙菌素颗粒剂拌料，其治愈率为89%。龙星[30]采用泰妙菌素治疗PPE，其治愈率为100%。这些抗菌药物虽抑菌效果好，但大多数药物由于问世和使用年限较长，其耐药性已非常严重，导致临床治疗效果不理想。如β-内酰胺类药物虽被广泛应用，但其与细胞膜的亲和力不高，难以进入细胞内，氟喹诺酮类药物虽能渗入宿主细胞内，且能达到较高的浓度，但对LI的敏感性不高，所以在兽医临床氟喹诺酮类药物很少用于治疗PPE。

2 纳米抗菌药物治疗胞内菌感染现状

目前已有多种抗菌药物通过纳米技术，被研制成纳米抗菌药物，用来治疗胞内菌的感染，如图1所示。不同纳米抗菌药物抗胞内菌感染的实例如表2所示。

表2 不同纳米抗菌药物抗胞内菌感染的实例Tab 2 The examples of different nano-antibacterial agents against intracellular infection

2.1 β-内酰胺类 作为许多细菌感染首选药物之一的β-内酰胺类药物，已有头孢曲松钠壳聚糖硫酸盐纳米胶囊、头孢曲松钠壳聚糖纳米粒等纳米药物被报道。其中Prakash等[31]制备的头孢曲松钠壳聚糖硫酸盐纳米胶囊被用来治疗胞内Salmonella的感染，将壳聚糖硫酸盐作为聚合物载药体时，头孢曲松钠壳聚糖硫酸盐纳米胶囊相比游离药物以更低的剂量有效地杀灭Salmonella。Zaki等[32]所制备的头孢曲松钠壳聚糖纳米粒，相比游离药物可显著降低巨噬细胞中鼠伤寒沙门菌的数量，提高头孢曲松抗胞内Salmonella的效果。以上β-内酰胺类纳米抗菌药物虽具有改善胞内抗生素递送能力，但难以完全根除胞内细菌的数量，且还存在载药量、稳定性、聚合物的降解性和粒径大小等诸多问题[32]。

2.2 氨基糖苷类 具有广谱抗菌的氨基糖苷类抗菌药物，已有庆大霉素-嵌段离聚复合物、庆大霉素聚乳酸-羟基乙酸等氨基糖苷类纳米抗菌药物被报道。Pothayee等[33]制备的庆大霉素-嵌段离聚复合物被用来治疗胞内Brucella的感染，该纳米药物由聚醚-聚丙烯酸酯共聚物与庆大霉素类结合，形成直径为170～340 nm的嵌段离聚复合物。庆大霉素-嵌段离聚复合物递送系统可显著降低鼠巨噬细胞内Brucella的数量，增强庆大霉素抗菌活性。Imbuluzqueta[34]所制备的庆大霉素聚乳酸-羟基乙酸可提高庆大霉素在胞内的蓄积能力，从而提高了其抗胞内LM感染的活性。以上氨基糖苷类纳米药物虽证明了它们的能力，即改善细胞外和体内抗生素递送的能力，具有很好的稳定性和药物有效载荷，但和β-内酰胺类纳米药物一样，难以完全根除胞内菌数量[35]。且由于氨基糖苷类药物极性较高，穿透细胞膜的速率非常缓慢，即使进入细胞内部，也几乎只保留在溶酶体中，而在溶酶体内的氨基糖苷类药物活性会因溶酶体的低pH值而降低，因此在临床上难以达到理想的治疗效果。

2.3 四环素类 目前已有盐酸多西环素悬浮剂、负载四环素的壳聚糖功能化MoS2纳米片、多西环素脂质体等四环素类纳米抗菌药物被报道。Li等[36]制备的盐酸多西环素悬浮剂以0.15 μg/mL的浓度可维持在胞内72 h以上，延长了盐酸多西环素的有效浓度和体外释放时间，且消除半衰期增加到9.77 h、平均停留时间增加到18.81 h，生物利用度提高了1.74倍。张旭[37]制备的壳聚糖功能化MoS2纳米片可有效抑制S.aureus生物膜的形成并破坏已建立的生物膜，且其最小抑菌浓度比四环素下降数十倍，增强了四环素对于胞内S.aureus和胞内Salmonella的抗菌活性。Franklin等[38]制备的多西环素脂质体被用来治疗胞内M.tb的感染，利用硫酸负载的方法制备多西环素脂质体，该药物递送系统可成功靶向巨噬细胞，且可以在胞内停留25～48 h，增强了多西环素的抗菌活性。以上四环素类纳米药物虽能够有较好的抑菌效果，但需频繁给药，费用高，且四环素类药物由于细胞膜穿透能力差，导致胞内药物浓度达不到抑菌水平，还易诱导细菌耐药[39]。

2.4 大环内酯类目前已有替米考星纳米凝胶、替米考星脂质体纳米粒、替米考星-脂质核纳米胶囊、克拉霉素脂质体等大环内酯类纳米抗菌药物被报道。Zhou等[40]制备的替米考星纳米凝胶被用来治疗胞内S.aureus的感染，采用固体脂质纳米技术与水凝胶技术相结合制备替米考星纳米凝胶，可显著降低替米考星用量和治疗奶牛乳腺炎成本。Rassouli等[41]制备的替米考星纳米结构脂质载体和替米考星-脂质核纳米胶囊相对于对照组替米考星，可有效降低替米考星对S.aureus的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。Li等[42]制备的克拉霉素脂质体被用来治疗胞内S.aureus的感染，利用脂质体改善克拉霉素的抗菌活性，可显耐著降低胞内S.aureus载量。以上大环内酯类纳米药物虽有较好的抗菌效果，利用脂质体纳米技术来改善抗菌药物的活性，与传统药物相比，具有低毒、减少给药频率的优势，但也存在药物滞留率低(3%～8%)、稳定性低，载药量少、容易被氧化和水解等问题[33]。且大环内酯类药物在胞内蓄积性能较弱和胞内酸性条件下活性较差，达不到理想治疗效果。

2.5 氟喹诺酮类 目前已有恩诺沙星固体脂质体纳米粒、托氟沙星纳米乳、复方恩诺沙星纳米乳等氟喹诺酮类纳米药物被报道。其中Xie等[43]制备的恩诺沙星固体脂质体纳米粒被用来治疗胞内Salmonella的感染，利用固体脂质体纳米技术改善恩诺沙星的抗菌活性，且恩诺沙星固体脂质体纳米粒是游离药物胞内蓄积能力的27.06～37.71倍，延长了恩诺沙星的抑菌时间，提高了恩诺沙星的抗菌效果。高娴[44]等制备的托氟沙星纳米乳被用来治疗胞内S.aureus和Salmonella的感染，托氟沙星纳米乳成功的解决托氟沙星难溶于水的问题，增强了托氟沙星的抗菌活性。王波臻等[45]制备的复方恩诺沙星纳米乳被用来治疗胞内S.aureus的感染，采用纳米乳技术和联合用药的方法，该复方恩诺沙星纳米乳可有效渗入皮肤，经皮肤给药后，成功靶向感染细胞，发挥更强的抗菌活性。以上氟喹诺酮类纳米药物虽有较好的抗菌效果，可渗入宿主细胞内，且能达到较高的浓度，但其在胞内停留时间短，难以达到有效抑菌时间。

2.6 其他 目前已有克拉唑银固体脂质体纳米粒、盐酸万古霉素固体脂质体纳米粒、利福平固体脂质体纳米粒、达托霉素固体脂质体纳米粒、克拉霉素固体脂质体纳米粒等纳米抗菌药物被报道。Kalhapur等[46]制备的克拉唑银固体脂质体纳米、盐酸万古霉素固体脂质体纳米被用来治疗胞内S.aureus的感染，通过固体脂质体纳米载药系统延长了盐酸万古霉素和克拉唑银对S.aureus的有效抑菌时间，从而提高了其对S.aureus的治疗效果。Bibi等[47]制备的利福平固体脂质体纳米粒被用来治疗S.aureus的感染，利用固体脂质体纳米粒载药系统将利福平成功释放于胞内，且显著减少S.aureus的生物被膜的形成，从而有效降低细菌的致病力。Li等[48]用制备的达托霉素固体脂质体纳米粒、克拉霉素固体脂质体纳米粒被用来治疗胞内S.aureus的感染，利用脂质体纳米技术提高了达托霉素和克拉霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性。以上纳米药物虽有较好的抗菌效果，利用脂质体纳米技术改善抗菌药物的活性，但还缺乏毒性和稳定性等相关研究。

3 结 语

通过纳米技术所制备的纳米抗菌药物可经过多种不同的转运途径进入宿主细胞内，显著提高抗菌药物对胞内菌感染的治疗效果。目前，纳米抗菌药物还存在着生产成本、稳定性、安全性等多种问题。故应根据抗菌药物的理化性质，采用合适的高分子载体材料，克服安全性、稳定性和载药量低等问题。深入纳米抗菌药物的相关研究，如粒径、电荷和分散系数等因素对于胞内纳米抗菌药物浓度和有效胞内停留时间的影响；同时根据特定胞内菌的生存策略，开发相应的纳米载药系统，通过纳米抗菌药物靶向性、持续性释放，提高胞内药物浓度和延长有效胞内停留时间。此外，应加强中草药纳米抗菌药物对胞内菌感染的相关研究[49]，通过药动学-药效学模型制定出纳米抗菌药物对胞内菌感染的合理给药方案[50]。相信随着纳米技术不断地成熟，更多的纳米抗菌药物将会应用到解决胞内菌感染的难题上来，提高其治愈率，避免其耐药性。