中国山羊痘弱毒疫苗AV41株基因组分子标记的比较分析

陆 游，南文龙，巩明霞，李 林，邹艳丽，吴晓东，彭大新，陈义平*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032)

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是一种由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)引发的急性、亚急性传染病[1]。该病临床表现为皮肤水肿及局部坚硬的结节、结痂或溃疡，怀孕牛流产，奶牛产奶量减少，公牛暂时或永久不育，商品牛的肉质或皮张利用率明显下降[2-3]。2019年8月，LSD疫情首次发生于我国新疆伊犁州，2020年6月以来，我国福建长汀、江西赣州、广东潮州、安徽黄山、浙江金华等地又确诊发生该疫情[4]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，农业农村部暂时将其作为二类动物疫病管理。

根据《牛结节性皮肤病防治技术规范》，我国采用山羊痘弱毒疫苗AV41株，按山羊的五倍剂量免疫牛来预防LSD[5]。但弱毒疫苗的使用可对LSDV野毒的诊断和监测产生干扰[6-7]。当前尚无AV41株的特异性鉴别检测方法，本研究拟筛选、验证AV41株基因组独特性分子标记，为该疫苗株与我国LSDV野毒株的鉴别提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 毒株 山羊痘弱毒疫苗AV41株购自哈药集团生物疫苗有限公司、山东绿都生物科技有限公司，山羊痘病毒+小反刍兽疫病毒二联弱毒疫苗(AV41株+Clone 9株)购自华派生物工程集团有限公司。中国LSDV野毒株LSDV/China/XJ2019-1由中国动物卫生与流行病学中心分离鉴定。

1.2 试剂与仪器 磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR扩增试剂2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)购自Vazyme公司，毛细管电泳仪及DNA Marker购自QIAGEN公司，引物由睿博兴科(青岛)有限公司合成。

1.3 病毒核酸提取 采用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒，提取中国LSDV野毒株和不同厂家来源的山羊痘弱毒疫苗AV41株的基因组DNA，厂家代号为A、B、C。

1.4 基因组分子标记筛选 从GenBank中下载已有的全部27 株LSDV基因组全序列(GenBank登录号：MN995838.1、MT130502.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT134042.1、MT643825.1、AF325528.1、AF409137.1、MH646674.1、MT992618.1、MN636843.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、MG972412.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、AF409138.1、MT134042.1)，除AV41株以外全部11 株GTPV基因组全序列(GenBank登录号：MN072621.1、KC951854.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1、MN072623.1、MN072620.1、KX576657.1、MW020570.1、AY077836.1、AY077835.1)和全部的12 株绵羊痘病毒(Sheep poxvirus，SPPV)基因组全序列(GenBank登录号：MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、MN072626.1、MW020571.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、KT438551.1、KT438550.1)。利用生物信息学软件BLAST和DNAstar，将AV41株基因组全序列(GenBank登录号：MH381810.1)逐段与上述LSDV、GTPV、SPPV基因组全序列进行比较，分析筛选AV41株基因组分子标记。

1.5 测序验证 于1.4筛选的AV41株分子标记所在的基因两侧序列设计引物，采用1.3方法制备的DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物测序，验证不同来源的AV41株相关分子标记位置的基因组序列，并与我国LSDV 野毒株基因相比较，确认AV41株基因组独特分子标记存在及分布情况。

反应体系25 μL：2×Vazyme Taq Plus Master Mix(Dye Plus)12.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，核酸模板2 μL，无核酸酶水8.5 μL。

反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃最后延伸6 min。PCR 反应结束，利用毛细管电泳仪分析结果，PCR 产物送睿博兴科(青岛)有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 基因组分子标记筛选 将AV41株基因组全序列与GenBank 数据库下载中的27株LSDV、11株GTPV、12株SPPV基因组全序列进行比较，共筛选获得19个AV41 株分子标记，包含4个插入标记，4个缺失标记和11个单核苷酸多态性(SNP)标记(表1)，而其余LSDV、GTPV、SPPV毒株基因组全序列对比结果中，尚未发现上述19个标记。根据分子标记所在基因两侧序列设计引物(表2)，其中，EEV maturation protein基因采用两组引物扩增，一组用于G2261T位点测序，另一组用于2285C2286与ΔC2293-2294两个位点测序。IL-1R基因的C582A和T571G位点采用同一组引物进行扩增测序。

表2 AV41 分子标记测序验证用PCR 引物Tab 2 PCR primers for molecular marker sequencing verification of AV41

2.2 测序验证 以中国LSDV野毒株和不同厂家生产的AV41株的基因组DNA为模板，对2.1中19个分子标记所在位置相应基因进行PCR扩增，毛细管电泳显示，扩增基因目的条带均与预期大小相符(图1)。经测序验证，并与LSDV野毒株基因组相关位置序列相比，其中7个为AV41基因组独有的分子标记，包括2个插入标记(DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832)和5个SNP位点标记(GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit 基因T64C和Myristylated protein基因C746A)，具体见表1与图2。

1：15-3000bp Marker；2：GTPV_gp001 gene；3：IL-1R gene；4：EEV maturation protein gene (G2261T)；5：GTPV_gp058 gene;6：GTPV_gp066gene；7：Virion core protein gene；8：DNA ligase gene；9：GTPV_gp021 gene；10：GTPV_gp020 gene；11：DNA-binding viron core protein gene；12：EEV maturation protein gene (2285C2286+ΔC2293～2294)；13：RNA polymerase subunit gene；14：Myristylated protein gene；15：TK gene；16：RING finger host range protein gene；17：Kelch-like protein gene；18：Ankyrin-like 图1 AV41分子标记所在基因PCR扩增结果Fig 1 PCR amplification of marker genes of AV41

NCBI AV41、NCBI 27 LSDVs、NCBI 11 GTPVs、NCBI 12 SPPVs：NCBI数据库中的1株AV41、27株LSDV、除AV41外的11株GTPV、12株SPPV序列；A-AV41、B-AV41、C-AV41：不同厂家生产的AV41；WT-LSDV：中国LSDV野毒株；方框所示碱基为差异碱基；“-”：表示该处碱基缺失NCBI AV41, NCBI 27 LSDVs, NCBI 11 GTPVs, NCBI 12 SPPVs：1 strain of AV41, 27 strains of LSDV, 11 strains of GTPV except for AV41 and 12 strains of SPPV in NCBI database; A- AV41, B- AV41 and C-AV41：AV41 strains produced by different manufacturers；WT-LSDV：wild-type LSDV in China. The bases shown in the box are different bases；"-"：base deletion图2 AV41 7个独特分子标记所在基因序列对比Fig 2 Sequence comparison of seven specific molecular markers for AV41

3 讨论与结论

牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒、绵羊痘病毒同为羊痘病毒属成员，相互间基因组全序列同源性高达95%[8]，编码主要抗原的基因序列相近。因此，采用同属同源或异源弱毒疫苗株进行免疫，都可预防牛结节性皮肤病。国际上用于LSD免疫的同源疫苗株有Neethling株与0240/KS-1株，异源疫苗株有SPPV RM65株与Romanian株，GTPV_Mysore株与Gorgan株等。非洲、中东、巴尔干等LSD流行地区的防控经验显示，采用弱毒疫苗免疫有效控制了该病的传播扩散[9-10]。

分子生物学方法是鉴别野毒株与疫苗株的主要手段，如荧光探针法和高分辨率熔解峰分析法(High-resolution melting,HRM)等。Eirini等根据Neethling株在G蛋白偶联趋化因子受体基因处插入的12 bp碱基，设计了双重探针的荧光定量PCR方法，可以区分Neethling_vaccine_LW疫苗株和LSDV_Turkey_2014等9种LSDV野毒株[11]。Tesfaye等基于SPPV疫苗株在B22R同源基因存在的21 bp与27 bp碱基缺失，建立了HRM分析法，可用于SPPV Romanian疫苗株等4种SPPV疫苗株与LSDV_Evros/GR/15等4种LSDV野毒株的鉴别[12- 13]。当前，我国尚未开发或从国外引进LSDV同源疫苗株。山羊痘弱毒疫苗AV41株可用于免疫山羊和绵羊预防GTPV与SPPV，已有近35年使用经历，证实其安全有效[14-15]。该疫苗株也可作为我国预防LSD的异源弱毒疫苗使用。鉴别诊断方面，聂福平等基于LSDV野毒株ORF126区域插入的26 bp碱基，建立了检测LSDV野毒株的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，仅特异性扩增LSDV野毒株相关基因，而对异源疫苗AV41株无扩增信号[16]。

目前，国内尚无直接鉴别检测AV41株的方法。本研究将AV41株基因组全序列与GenBank中的LSDV、GTPV和SPPV毒株序列比较，对中国LSDV野毒株和不同厂家生产的AV41株相关基因测序，证实其中7 个分子标记为AV41株独特性，包括DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832、GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit基因T64C、Myristylated protein基因C746A。上述结果显示，所选分子标记可用于我国山羊痘弱毒AV41株和LSDV野毒株的病原鉴别，即对分子标记位置采用直接测序的方法，可鉴定为疫苗株或野毒株；或基于分子标记中的SNP位点，开发可用于区分相关SNP位点的荧光定量PCR方法；或基于插入位点，建立可区分野毒株与疫苗株不同熔解曲线峰图的高分辨率熔解峰分析法等。本研究可为我国LSD防控工作提供技术支持，也可进一步为山羊痘弱毒AV41株与国内山羊痘病毒、绵羊痘病毒野毒株的鉴别提供参考。