血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究

侯力丹，王 嘉，刘 丹，陈晓春，翟天舒，杨承槐，杨汉春，毛娅卿*，李俊平*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)是鸡、鸭等禽体内常见的传染性病毒之一。自2015年6月以来，我国山东、河南、河北等省份的部分地区鸡群中发生了以心包积液和肝脏肿大为特征的传染病。经过大量的研究，确定该病是由血清4型的I群FAdV所引起[1]。在我国五个省市的家禽养殖场，发现至少有三种FAdV (FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E)的流行，并且在包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)和心包积水综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome, HPS)病例中的混合感染很常见[2-4]。Chen等[5]在2015-2018年收集我国15个省市共计280份病料，发现155份存在有腺病毒感染，其中FAdV-4型占比79.4%，FAdV-8a型占比13.5%，FAdV-8b型占比3.9%。

近年来，为了防控禽腺病毒病，我国通过不同的方式开展了疫苗研制工作，而在疫苗研制过程中标准化且毒力稳定的检验强毒株是评价疫苗的重要标准物质。本研究于2016年从山东地区发生心包积液的疑似腺病毒感染鸡群中采集病料进行了病毒分离鉴定，获得1株血清4型FAdV GY株，并对其进行了纯化、鉴定、种子批的建立和致病力的测定，以期通过研制提供可靠的检验用强毒株，为疫苗的研制和评价奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源及样本处理 2016年，山东某鸡场疑似发生禽腺病毒感染，发病鸡剖检表现为严重的心包积液，呈透明的淡黄色或浅褐色，肝脏肿大、变脆、出血或坏死，采集其肝、脾等组织。将从剖检见肝脏病变坏死病鸡中采集的肝脏组织3～4 g，按肝脏组织(g)∶PBS(mL)为1∶5的比例加入无菌PBS，放入匀浆器中，经-80 ℃反复冻融3次，4 ℃ 12000 r/min离心5 min，收取上清，用0.22 μm的细菌滤器过滤，分装于1.5 mL离心管中备用。

1.2 PCR检测与测序 提取病料样本的DNA，用针对FAdV的Hexon基因ORF设计如下特异性引物进行PCR扩增，上游引物P1：5′-GAGATGGTGACGGAGGTG′-3′；下游引物P2：5′-AAGCGGTGACGAGGATGC-3′，目的片段大小为3139 bp。通过琼脂糖凝胶电泳检测后，对PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果与表1中FAdV的12种血清型参考毒株序列进行同源性比对和遗传进化分析。

表1 FAdV的12种血清型参考毒株信息Tab 1 Information of 12 serotypes of reference strains of FAdV

1.3 病毒分离纯化与鉴定 将1.1制备的样品按5%的剂量，接种长满单层的LMH细胞，吸附1 h后，补充含1%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃ 5%的CO2培养箱中培养，逐日观察，72 h收获。反复冻融3次后离心收获上清，作100倍稀释后，取1 mL上清加入0.5 mL氯仿，于4 ℃摇床中振摇1 h，12000 r/min离心20 min，轻轻取出离心管，吸取上层液体0.5 mL，于生物安全柜中开口放置30 min(用于挥发残留的氯仿)备用。处理好的病毒液，再进行10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-43个稀释度，每个稀释度接种2孔长满单层的LMH细胞板，0.1 mL/孔，吸附1 h，弃去上清，1%琼脂糖覆盖后，倒置培养72 h。倒置显微镜下观察，在出现细胞病变的最高稀释度孔中，选取单个细胞病变斑3个，每个斑无菌挑取至1 mL DMEM中，冻融3次后，离心取上清进行10 倍、100 倍稀释，将原倍、10 倍、100 倍稀释的病毒液按前述方法进行继续克隆，上一代克隆获得的每个克隆后续克隆挑取1个克隆，共克隆3代。最后1代每个克隆分别接种1个25 cm2的LMH细胞瓶，待细胞病变达70%以上后置-70 ℃以下保存，为C0代。纯化获得的克隆病毒按1.2方法进行Hexon PCR扩增，测序分析。

1.4 种子批的建立与检定 将FAdV-GY株C0代毒接种2个长满LMH单层的175 cm2细胞瓶中，每个接种1 mL，37 ℃继续培养，待细胞病变达80%以上后-70 ℃以下保存，为FAdV-GY株 C1代。收获的病毒按《中国兽药典》附录进行病毒含量测定、无菌检验和支原体检验。用制备的病毒液制备成灭活疫苗第一次免疫，皮下注射免疫3 周龄SPF鸡20 只，0.3 mL/只。21 d后，将制备的病毒液10倍稀释进行第二次免疫，每只鸡点眼、滴鼻各1 滴，加肌肉注射三种途径共0.5 mL。第二次免疫21 d后按第二次免疫的方法进行第三次免疫，第三次免疫后21 d翅静脉采血分离血清，按《中国兽药典》附录3305外源病毒检验中鸡检查法进行抗体检测(表2)，以确定是否存在其他外源病毒。

表2 外源病毒检测种类及检测方法Tab 2 Methods of exogenous virus detection

1.5 GY株致病性研究 将FAdV-GY株 C1代毒种用灭菌生理盐水分别稀释至病毒含量为： 106.0TCID50/0.1mL、105.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、103.0TCID50/0.1mL共4个病毒含量梯度，每个病毒含量梯度经胸部肌肉接种4、8周龄SPF鸡各5只，每只0.5 mL，同时4、8 周龄SPF鸡分别设生理盐水接种对照5只。攻毒后观察14 d，详细记录接种鸡的发病和死亡情况，死亡鸡立即进行剖检，观察到期后未死亡鸡处死剖检，以判定不同攻毒剂量对不同周龄SPF鸡的致病性。取GY株C1代病毒液，稀释至105.0TCID50/0.1mL，胸部肌肉注射和皮下注射两种途径分别接种8周龄SPF鸡，每只0.5 mL，每组5只，同时设5只不接种作为对照，攻毒后观察14 d，详细记录接种鸡的发病和死亡情况，死亡鸡立即进行剖检，观察到期后未死亡鸡进行处死剖检，以判定不同攻毒途径对SPF鸡的致病性。另将GY株C1代病毒液，稀释至105.0TCID50/0.1mL，经胸部肌肉接种SPF鸡20 只，每只0.5 mL，平均分2组，同时设同日龄SPF鸡10只不攻毒作为对照。攻毒后1组观察7 d，另一组观察14 d，详细记录接种鸡的发病和死亡情况，死亡鸡立即进行剖检，观察到期后将未死亡鸡处死剖检，观察发病规律和剖检病理变化。

2 结果与分析

2.1 分离病毒的PCR检测和测序结果 针对FAdV的Hexon基因特异性引物对病料样品提取核酸进行PCR检测，可扩增出约3139 bp大小的预期目的片段(图1)，初步判断分离物中含有FAdV。PCR回收产物测序结果与表1所列12个血清型代表毒株Hexon序列比对结果表明，分离病毒与FAdV血清4型的同源性最高，达98.7%，与同一基因型的血清10型序列同源性次之为97.4%，与其他基因型代表毒株的同源性为67.9%～76.8%，与血清4型处于同一个分支(图2)，初步判定临床分离病毒为I群FAdV基因C型，血清4型。

图2 FAdV不同血清型参考毒株hexon基因遗传进化分析Fig 2 Genetic evolution analysis of Hexon gene of different serumtypes reference strains of FAdV

2.2 病毒的分离纯化与鉴定 处理后的样品接种LMH细胞后第一代即观察到明显的细胞病变，约在接种后48 h后开始出现疑似细胞病变，72 h后细胞病变明显。第一代培养物按10%剂量接种第二代后36 h 80%以上细胞出现细胞病变，主要表现为细胞圆缩、脱落、聚集成团、细胞破损(图3)。收获病毒液置于-70 ℃以下保存。

A: 正常的LMH细胞对照；B: 感染GY株的LMH细胞A: Normal LMH cell control; B: LMH cells infected by GY strain图3 分离病毒在LMH细胞上导致的细胞病变Fig 3 Cytopathic effect of isolated virus on LMH cells

氯仿处理后的病毒液经3代琼脂覆盖筛选蚀斑，获得3个克隆株病毒，分别命名为FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2和FAdV-GY株C0-3。纯化获得的三株病毒Hexon基因PCR扩增结果一致，均出现约3139 bp左右特异条带(图4)，PCR测序结果与2.1初步分离鉴定序列同源性为100%，初步说明克隆获得的3个克隆株为同一株病毒。将FAdV-GY株C0-1克隆株病毒接种2个175 cm2的LMH单层，收获150 mL病毒液，标记为FAdV-GY株C1代，收获病毒的病毒含量测定结果为107.5TCID50/0.1 mL，表明实验室分离到的FAdV-GY株病毒能适应LMH细胞。纯净性检验结果表明，FAdV-GY株C1代病毒液无细菌、霉菌及支原体污染。按《中国兽药典》鸡检查法对FAdV-GY株C1代病毒液进行外源病毒检验，结果显示接种SPF鸡检测抗体除禽腺病毒抗体阳性外，其它病原抗体的检测结果均为阴性，表明FAdV-GY株C1代病毒无外源病毒污染。

M: DNA分子质量标准DL5000；1：FAdV-GY株C0-1；2：FAdV-GY株C0-2；3：FAdV-GY株C0-3；4：阴性对照M: Marker DL5000; 1: FAdV-GY C0-1; 2: FAdV-GY C0-2;3: FAdV-GY C0-3; 4: Negative control图4 不同克隆株病毒PCR检测结果Fig 4 PCR detection results of different cloned viruses

2.3 不同攻毒剂量对不同周龄SPF鸡的致病性 用不同剂量的GY株C1代病毒液分别经胸部肌肉接种4周龄和8周龄SPF鸡，攻毒后观察14 d。试验结果显示，不同周龄SPF鸡攻击5×103.0TCID50/0.1mL 及以上的GY株病毒液后引起不同程度的感染和死亡，攻击5×104.0TCID50/0.1mL的GY株病毒液可以引起5/5发病，死亡率不低于4/5。发病鸡主要表现为精神不振、不愿行走、羽毛蓬松、嗜睡等；死亡鸡剖检主要表现为心包积液、肝脏出血或坏死；有临床症状未死亡鸡剖检病变不明显，部分鸡出血心包少量积液或心包膜轻度浑浊；未出现临床症状鸡剖检无肉眼可见病变。对照鸡均无临床症状和剖检病变。结果见表3、图5、图6。

表3 GY株不同攻毒剂量对4周龄和8周龄SPF鸡的致病性研究结果Tab 3 Pathogenicity of different challenge doses of GY strains on 4 weeks and 8 weeks SPF chickens

A: 攻毒后50 h死亡鸡；B: 攻毒后72 h死亡鸡；C: 发病但未死亡鸡；D: 对照鸡A: Dead chickens 50 h after challenge; B: Dead chickens 72 h after challenge;C: Chickens with disease but not death; D: Control chickens图5 4周龄SPF鸡攻毒剖检照片Fig 5 Profile of challenged SPF chickens aged 4 weeks

A: 攻毒后72 h死亡鸡；B: 攻毒后97 h死亡鸡；C: 攻毒后120 h死亡鸡；D: 对照鸡A: Dead chickens 72 h after challenge; B: Dead chickens 97 h after challenge;C: Dead chickens 120 h after challenge; D: Control chickens图6 8周龄SPF鸡攻毒剖检照片Fig 6 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

2.4 不同攻毒途径对SPF鸡的致病性 取GY株C1代病毒液分别经胸部肌肉注射和皮下注射两种途径接种8周龄SPF鸡，每只0.5 mL(含5×105.0TCID50)，攻毒后观察14日。结果显示，肌肉注射途径SPF鸡发病率为5/5，死亡率为5/5；皮下注射途径发病率为4/5，死亡率4/5。肌肉注射途径 SPF鸡的死亡时间为攻毒后2～4日，比皮下注射途径的死亡时间(3～5日)略早，对照鸡5/5正常。

2.5 发病规律和剖检病变研究 GY株C1代病毒液经胸部肌肉攻击8周龄SPF鸡。临床观察结果显示，攻毒后2～3日开始表现临床症状，主要表现为精神沉郁、羽毛蓬乱、不愿走动、闭眼嗜睡等，发病率达20/20。攻毒后24 h开始发现攻毒鸡出现临床症状，死亡集中在3～5日，死亡鸡严重心包积液，肝脏有肿大、出血或坏死。攻毒后观察7日和14日组，死亡率均为9/10。观察7日组未死亡鸡剖检心包有明显积液，肝脏有明显坏死灶；观察14日组未死亡鸡临床症状减轻至消失，剖检心包未见积液，但心包有轻度浑浊，肝脏未见明显病变(图7)。

A 攻毒后7 d未死亡鸡；B 攻毒后14 d未死亡鸡A: Dead chickens 7 days after challenge; B: Dead chickens 14 days after challenge图7 8周龄SPF鸡攻毒剖检照片Fig 7 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

3 讨论与结论

FAdV是全世界家禽和野禽常见的垂直传播性病毒之一，自1987年，巴基斯坦首次报道心包积液综合征后[6]，美国等多个国家也相继出现该病的报道[7]。在我国鸡心包积液-肝炎综合征的临床病例中，血清4型最为流行。本研究在2016年也从山东某疑似感染鸡群中经LMH细胞分离鉴定到一株血清4型的FAdV并定名为GY株，以期在充分观察其致病性基础上探索其作为标准强毒株的可能性。

FAdV的血清型众多，不同的血清型致病性不同，因此对血清型的分离鉴定及致病性的研究显得尤为重要。随着分子生物学技术的发展，核苷酸序列测定与比对已被广泛应用于FAdV的检测与分型[7,8]。Hexon蛋白是FAdV的主要结构蛋白，通过对Hexon基因进行测序与遗传进化比对，可准确区分FAdV不同的血清型[9]，因此常被作为FAdV基因分型的靶基因[10-11]。本研究在接种LMH细胞进行病毒分离培养基础上进一步对该毒株的Hexon基因进行同源性比对及遗传进化分析，发现该株病毒与其他血清4型参考株属于同一分支，确定分离的毒株属于血清4型FAdV。

许多FAdV可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不出现感染症状，但有一些因素，特别是与其它病原并发感染时，FAdV可作为继发病原引起鸡群发病和死亡。特别是与鸡传染性贫血病毒等免疫抑制病毒发生混合感染后可增强FAdV的毒力，如有研究表明，在使用含有FAdV和CIAV共污染的新城疫疫苗后，CIAV能协助FAdV破坏母源抗体的保护作用，引起机体发病，而单污染则不会引起明显症状[12-13]。这提示我们，要客观评价FAdV的致病性，首先需要确保其纯净性。为此，本研究首先经3代琼脂覆盖筛选蚀斑，获得3个FAdV-GY株克隆株病毒，纯化获得的FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2、FAdV-GY株C0-3病毒Hexon基因PCR扩增结果一致，均出现约3139 bp左右特异条带，初步证实纯化的毒株具有较好的特异性。不仅如此，本研究还严格按《中国兽药典》鸡检查法对C1代FAdV-GY株病毒液进行了针对多达17种外源病毒的检验，证实FAdV-GY株C1代病毒无外源病毒污染，建立了纯净度高的FAdV-GY株种子批。

开发安全有效的疫苗是防控FAdV感染的当务之急，对此国内外已经有大量的研究报道[14-16]，而评价疫苗是否有效的关键因素之一是需要有经过毒力验证的标准检验用强毒株。近期，已有多个报道对血清4型的FAdV致病性和发病规律开展了观察[17-19]。本研究则利用经过纯化和外源病毒检测的FAdV-GY株C1代种子批对其致病性开展了系统研究，特别是从不同感染途径和不同感染剂量等方面进行了相对全面的观察。结果证实，经胸部肌肉注射后发病率和发病时间相对于颈部皮下注射途径更有优势，确定将攻毒途径定为肌肉注射。在四个不同梯度感染剂量中，以不低于5×104.0的剂量攻毒，可引起100%的4周龄和8周龄SPF鸡发病，80%以上死亡，为确保攻毒试验结果稳定可靠，将攻毒剂量定为每只鸡5×105.0TCID50。在多次实验中，SPF鸡于攻毒后2日开始有鸡出现精神不振、羽毛蓬乱、不愿走动、闭眼嗜睡等临床症状，出现上述症状后1～2 d大部分发病鸡死亡，有的试验鸡未见明显的临床症状死亡，死亡鸡剖检均可见心包积液及肝脏肿大、出血或坏死等病变；对出现临床症状未死亡的鸡在攻毒后7日进行剖检，亦可见典型的心包积液及肝脏肿大、出血等病变；出现临床症状未死亡鸡观察至攻毒后14 d，发病鸡临床症状减轻或消失，心包积液及肝脏肿大、出血等病变不明显，可见攻毒后观察7 d未死亡鸡剖检病变更明显。依据多次攻毒试验临床观察和剖检制定了该强毒株的发病判定标准，即出现任意一项即判为发病：(1)死亡；(2)鸡只出现精神不振、羽毛蓬乱、不愿走动、嗜睡等任两项临床症状；(3)剖检出现心包积液或肝脏肿大、出血或坏死等病理变化。

本研究完成了FAdV-GY株的分离鉴定、种子批建立、纯净性和致病性的研究，确定FAdV GY株作为攻毒用毒的攻毒途径、剂量和发病标准，成功制备了可用于评判FAdV相关生物制品有效性的标准强毒株，为FAdV生物制品的研发奠定物质基础。