酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱的工艺优化

宁娜，韩建军，胡宇莉

(1.铜仁职业技术学院药学院，贵州铜仁 554300；2.贵州省中兽药工程研究中心，贵州铜仁 554300；3.重庆市动物疾病预防控制中心，重庆 401120)



酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱的工艺优化

宁娜1,2，韩建军1,2，胡宇莉3

(1.铜仁职业技术学院药学院，贵州铜仁 554300；2.贵州省中兽药工程研究中心，贵州铜仁 554300；3.重庆市动物疾病预防控制中心，重庆 401120)

为了优化酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱的工艺，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用4因素3水平的响应面分析法，以小檗碱收率为响应值进行回归分析。结果表明，酶解最佳工艺条件为：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解温度51 ℃、酶解时间97 min。在此条件下，小檗碱收率为22.46 mg/g。优选的提取工艺稳定可行、收率高，为功劳木的工业化生产提供参考。

功劳木；小檗碱；纤维素酶；超声提取

功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fort.) Carr.或细叶十大功劳Mahoniafortunei(Lindl.) Fedde的干燥茎，其性寒味苦，具清热燥湿、泻火解毒的作用，主治肠黄泻痢、湿热黄疸等症[1]。功劳木含多种生物碱类成分，其中小檗碱为主要药效成分[1-2]。研究表明小檗碱可促进肉鸡的生长代谢[3]、提高肉兔屠宰率[4]、改善肉兔脂质代谢及增强机体抗氧化机能[5]等作用。

酶法辅助超声提取作为植物有效成分提取的一种联用技术，通常先用适宜的酶对植物进行预处理，继而利用超声仪进行有效成分的提取[6]。酶法辅助超声提取作为一种新型联用提取技术，已被应用于两面针[7]、蓖麻叶[8]、紫苏叶[9]等多种植物有效成分提取中。目前已报到的功劳木提取方法主要有回流法[10]和超声法[11]。本文首次将超声波法和酶法联合应用于功劳木小檗碱的提取中，在单因素试验基础上，利用响应面法优化酶解工艺，为功劳木深度开发和综合利提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 FA1004B电子天平(奥克斯国际贸易上海有限公司)；KQ-500DE台式数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；PHS-25型数字式显示酸度计(上海伟业仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 药品与试剂 功劳木药材(采自贵州省安顺市布依族苗族自治县六马乡)，经本院梁玉勇教授鉴定；小檗碱对照品(批号：110713-201212)，中国食品药品检定研究院；纤维素酶(酶活力：11000 U/g)，宁夏夏盛实业集团有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为双蒸水。

1.3 方法

1.3.1 小檗碱的提取

1.3.1.1 酶法辅助超声提取 取干燥的功劳木药材粉碎并过60 目筛。准确称取15 g置于装有150 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液的锥形瓶中，按照设定酶解条件(酶解pH值、酶用量、酶解温度、酶解时间)进行酶解后，过滤，并向经过酶解处理的功劳木药材中加入120 mL 70%乙醇，在超声功率为400 W的条件下超声提取30 min，过滤，合并提取液，即得到功劳木提取液。

1.3.1.2 回流法提取 取干燥的功劳木药材粉碎并过60目筛。准确称取15 g置于圆底烧瓶中，加入120 mL 70%乙醇，乙醇热回流提取3次，每次120 min。合并3次提取液，即得到功劳木提取液。

1.3.1.3 超声法提取 取干燥的功劳木药材粉碎并过60目筛。准确称取15 g置于装有150 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液的锥形瓶中，在提取pH值为3.5，提取温度为51 ℃的条件下提取97 min后收集滤液，向药材中加入120 mL 70%乙醇，在超声功率为400W的条件下超声提取30 min，过滤，合并提取液，即得到功劳木提取液。

1.3.2 小檗碱的含量测定

1.3.2.1 测定条件 采用HPLC法测定小檗碱含量[1]，色谱条件为：Diomansil-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调pH值至3.0)(30∶70)为流动相，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长265 nm，进样体积10 μL。

1.3.2.2 测定方法 将功劳木提取液浓缩至100 mL，然后精密吸取0.3 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。供试品溶液按照1.3.2.1色谱条件进行测定，记录峰面积并计算小檗碱收率。其中，小檗碱收率(mg/g)是指从每克功劳木药材粉末中提取得到的小檗碱的量(mg)。

1.3.3 功劳木小檗碱提取的响应面优化 基于前期单因素预试验的结果，采用Box-Behnken设计方法，对影响酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱的关键因素进行研究。以小檗碱收率为响应值，以酶解pH值、酶用量、酶解温度和酶解时间为自变量，试验设计见表1。

2 结果与分析

2.1 小檗碱的含量测定结果 小檗碱对照品及功劳木药材按照1.3.2.1项下色谱条件测定得到色谱图，见图1。以峰面积Y对小檗碱浓度X(μg/mL)进行回归，得到回归方程为：Y=99.51X+450.47 (R2=0.9999)，线性范围为：5.00～50.00 μg/mL。

表1 响应面试验设计因素及水平表Tab 1 Factors and levels used in response surface design

图1 小檗碱对照品(A)和功劳木药材(B)的HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms of berberine in standard (A) and Mahonia bealei (B)

2.2 酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱的工艺优化

2.2.1 响应面分析及试验结果 超声辅助酶法提取功劳木小檗碱的响应面试验结果见表2,对各因素进行回归拟合，得到二次回归方程：

Y=-861.8588+212.2317X1+13.9836X2+15.2670X3+1.1884X4+0.3117X1X2-0.3280X1X3-0.0155X1X4-0.0858X2X3-0.0117X2X4-0.0109X3X4-28.6350X12-0.4506X22-0.1201X32-0.0024X42。

利用Design-Expert 8.0.6对该回归模型进行方差分析，结果表明：该模型达极显著水平，失拟项不显著，模型总决定系数R2=0.9841，校正决定系数RAdj2=0.9655，说明该模型拟合情况较好，可用该模型适宜用于超声辅助酶法提取功劳木小檗碱工艺条件的优化。通过方差分析结果中的P值可知：X2、X1X3、X2X4均对小檗碱收率的影响显著(P<0.05)，X1、X3、X4、X12、X22、X32、X42、X2X3、X3X4均对小檗碱收率的影响极显著(P<0.01)。通过方差分析结果中的F值可知：各因素对小檗碱收率影响的顺序依次为：酶解pH值>酶解时间>酶解温度>酶用量。

2.2.2 响应面分析 响应面图可直观反映两两因素交互作用对响应值的影响程度，其坡度陡峭程度与两两因素交互作用对响应值影响大小呈正比关系[12]。根据回归方程得到两两因素之间交互作用对小檗碱收率影响的响应面图，见图2。由图2和方差分析结果可知，酶解pH值与酶解温度、酶用量与酶解时间对小檗碱收率的影响达到显著水平，而酶用量与酶解温度、酶解温度与酶解时间对小檗碱收率的影响达到极显著水平。

2.2.3 最佳工艺条件验证 通过响应面优化得到酶法辅助超声提取功劳木小檗碱的酶解最优参数为：酶解pH值3.45、酶用量10.62 mg/g、酶解温度50.67 ℃、酶解时间97.02 min，该条件下模型预测小檗碱的理论收率为22.64 mg/g。考虑实际可操作性，将酶解最优工艺参数修正为：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解温度51 ℃、酶解时间97 min。在该修正条件下进行3次平行试验，得到小檗碱的平均收率为22.46 mg/g，RSD=0.52%(n=3)，试验结果与模型预测相对误差为0.80%，与理论值接近，表明建立的数学模型对功劳木小檗碱提取工艺具有实用价值。另取同等质量功劳木药材粉末6份，其中3份按照1.3.1.2回流法提取，其余3份按照1.3.1.3超声法进行提取。结果表明，回流法中小檗碱平均收率为17.27 mg/g，RSD=0.41%(n=3)；超声法中小檗碱平均收率为8.24 mg/g，RSD=0.61%(n=3)。

表2 响应面试验设计及结果Tab 2 Experimental design and results for response surface analysis

图2 各因素相互作用对小檗碱收率影响的响应面Fig 2 Response surface of interaction between every two factors on extraction rate of berberine

3 讨论与小结

小檗碱作为功劳木的主要有效成分，已被广泛应用于兽医临床实践中。如硫酸小檗碱注射液、盐酸环丙沙星盐酸小檗碱预混剂、诺氟沙星盐酸小檗碱预混剂等常用兽药均含有小檗碱成分。目前功劳木中小檗碱的提取主要有常规的回流提取法[10]和超声法[11]，其他提取方法鲜有报道。超声波是利用震动波增强提取溶剂对植物药材的渗透力，从而达到高效提取的目的，同时避免高温对植物药材有效成分的影响。将酶法与超声波结合，可在低温环境下加速植物细胞内有效成分溶出，从而使提取时间及有效成分得率得到最优化。基于上述优点，本研究采用酶法辅助超声这一新型联用技术提取功劳木小檗碱成分，为功劳木的资源开发利用提供参考。

单因素试验中，小檗碱收率随着酶解pH值和酶解温度的增大而增大，但当酶解pH值3.5以上、酶解温度50 ℃以上，小檗碱收率反而下降，可能与酶的空间结构改变、酶失活等因素有关。小檗碱收率随着酶用量的增加而增大，但当酶用量11 mg/g以上，小檗碱收率反而下降，可能当纤维素酶相对于功劳木达到饱和后继续增加纤维素酶用量会阻碍小檗碱的溶出。小檗碱收率随着酶解时间的延长而增大，但当酶解时间90 min以上，小檗碱收率增加趋势趋于平缓。

通过响应面法及验证试验得到超声辅助酶法提取功劳木小檗碱的酶解最佳工艺条件为：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解温度51 ℃、酶解时间97 min。通过响应面法得到的功劳木小檗碱超声辅助酶法提取工艺与常规的回流法相比，小檗碱收率提高了31%，耗时仅为回流法的1/3；与常规的超声法相比，酶解预处理步骤使功劳木中小檗碱收率提高了2.7倍。综上所述，本研究优选的酶法辅助超声提取功劳木中小檗碱工艺具有提取时间短、提取效率高等优点，为功劳木的工业化生产提供参考。

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(编辑：陈希)

Optimization of Emzyme-assisted Ultrasonic Extraction Process for Berberine fromMahoniabealei

NING Na1,2, HAN Jian-jun1,2, HU Yu-li3

(1.DepartmentofPhamrmacy,TongrenVocationalandTechnicalCollege,Tongren,Guizhou554300,China; 2.EngineeringResearchCenterofVeterinaryTraditionalChineseMedicineinGuizhou,Tongren554300,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofChongqing,Chongqing401120,China)

To optimize emzyme-assisted ultrasonic extraction process of berberine fromMahoniabealei. Experimental factors and their levels were determined by one-factor tests. Subsequently, the Box-Behnken experimental design with 4 factors and 3 levels was performd, and the factors influencing the extraction process were estimated by means of regression analysis with the berberine yield as the response value. The optimal conditions were as follows: pH 3.5, cellulase dosage 10.6 mg/g, enzymolysis temperature 51 ℃, enzymolysis time 97 min. Under this condition, the berberine yield was up to 22.46 mg/g. The optimized extraction technique is stable and feasible, with a high extraction rate, providing reference for industrialized production ofMahoniabealei.

Mahoniabealei; berberine; cellulase; ultrasonic extraction

贵州省农业类工程技术研究中心项目：黔科合农G字[2015]4001号；贵州省铜仁市科技局科研计划项目：铜市科研2016(98)号 作者简介： 宁娜，博士，副教授，从事药用资源的开发利用工作。E-mail: ningnaok@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.04

2017-03-05

A

1002-1280 (2017) 06-0027-06

S853.7