滇南某猪群致死性呼吸道传染病的病原学诊断

郑玉芳，陶永艳，杨代泽，杨春艳，吴雨涵，陈培富**

(1. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.云南省耿马县耿马镇农业中心，云南临沧 677500； 3. 楚雄州动物疫病预防控制中心，云南楚雄 675000)

滇南某猪群致死性呼吸道传染病的病原学诊断

郑玉芳1，陶永艳2，杨代泽1，杨春艳3，吴雨涵1，陈培富1**

(1. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.云南省耿马县耿马镇农业中心，云南临沧 677500； 3. 楚雄州动物疫病预防控制中心，云南楚雄 675000)

近期红河州某规模化养猪场在引种后，发生以发热、腹泻、呼吸困难、濒死前鼻孔出血为特征的仔猪传染病，尝试用多种药物治疗均不能有效控制病情，死亡率很高。为调查该病病因，本试验对采集自病死猪只的肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结，取病料组织划线于血琼脂平板培养，对形成的溶血性菌落采用高盐培养、革兰染色、生化试验做初步鉴定，同时使用细菌16S rRNA基因通用引物扩增该菌株DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，经TA克隆后测序分析；取病料组织研磨上清，应用PCR技术扩增病原核酸，以类似方法分析核酸序列。结果发现，该溶血性菌株为革兰染色阳性球菌，葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇和6.5% NaCl利用试验呈阳性，麦芽糖、棉籽糖、蕈糖、七叶苷、水杨苷、VP、 PYR、硝酸盐和触酶试验均呈阴性，PCR扩增出1542 bp的特异性条带，其基因序列与脲气球菌同源性最高(94%)；应用PCR技术从病料中分别直接扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)421 bp和支原体267 bp的特异性条带，前者为高致病性PRRSV毒株特有核酸片段，后者与猪鼻支原体(MHR)SK76菌株的DNA同源性达99%。试验结果表明，该猪群发生以高致病性PRRSV感染为主、伴有猪鼻支原体和类脲气球菌混合感染的急性传染病，提示必须高度重视引种携带PRRSV的风险。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪鼻支原体；类脲气球菌；混合感染；PCR

近年来，急性呼吸道疾病已成为严重危害猪群健康和制约养猪业发展的一类疾病。规模化养猪场常见的呼吸道疾病有猪繁殖与呼吸综合征、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎、猪流行性感冒、猪支原体感染等。呼吸道疾病的混合感染在现代养猪业中也是常见现象，混合感染比单一的病毒或者细菌感染导致的病情更加严重[1]，给饲养人员和兽医在诊断和防治疾病方面带来巨大的困扰和挑战[2]。2015年秋季，红河洲某规模化养猪场暴发一起急性呼吸道传染病，经应用多种药物治疗，均不能控制病情，其病因值得调查。本试验根据该猪场病猪症状，怀疑为猪繁殖与呼吸综合征与细菌混合感染所致，随后进行病原菌的分离培养与鉴定，并应用PCR技术检测病原体核酸，以期做出确诊。

1 材料与方法

1.1 材料 病料采集自红河自治州某规模化养猪场的2头病死猪，包括猪肺脏、脾脏、淋巴结和肾脏。病猪有发热、腹泻、呼吸困难、濒死前鼻孔出血等临床症状，用β内酰胺类治疗无效，磺胺类、替米考星等抗菌药物的疗效不佳。到采集病料时，发病的120头仔猪中仅剩下数头尚未死亡。对病死猪做病例剖检，可见肺脏呈虾肉样病变，并与胸膜粘连，胸腔有积液，肝脏有肿块。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养与鉴定 取病死猪脾脏，以接种环触碰横切面，划线于绵羊血琼脂培养基，置于37 ℃温箱培养过夜。观察菌落形态，挑取具有溶血能力的单菌落转种至新培养基，确保获得纯培养物后，做液体扩大培养，取部分菌液加入50%灭菌甘油混匀，-20 ℃保存，随后取少许剩余菌液，按照常规步骤进行革兰染色，镜检细菌个体形态。

取250 μL菌液均匀涂布于高盐琼脂培养基，或从单菌落蘸取少许细菌划线接种于该琼脂培养基，然后置于37 ℃温箱中过夜培养，观察细菌在高盐环境下的生长情况。

用接种环挑取菌液分别接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、棉籽糖、VP管、木糖、硝酸盐、七叶苷、6.5% NaCl、吡咯烷酮(PYR)、蕈糖、水杨苷等13种生化发酵管，放入37 ℃培养箱培养，观察颜色变化和气泡产生情况。触酶试验在洁净玻片完成，受试样滴加3% H2O2溶液1滴，以滴加生理盐水1滴作为对照。

为对分离菌株的16S rRNA基因进行克隆与分析，取菌液500 μL用超声波快速破碎，从中取2 μL细菌裂解物作为模板，加入细菌16S rRNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGCTGGATCACCTCCTT-3′[3])各1 μL，加入Mix 23 μL及ddH2O 23 μL，按95 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，进行PCR扩增，共循环35次，72 ℃充分延伸10 min。取扩增产物做1%琼脂糖凝胶电泳，检查是否产生符合预期大小的单一条带。依照所购试剂盒说明书，割胶并回收PCR产物，以pMD-19T为核酸载体进行TA克隆，随后按常规方法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，取100～300 μL涂布平板(AMP/IPTG/X-Gal阳性)，37 ℃培养过夜，挑取白色菌落转种至含AMP的LB液体培养基，37 ℃摇动培养，送专业公司做DNA测序，所获核酸序列做在线比对分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.2.2 PRRSV核酸片段的RT-PCR扩增 在无菌条件下，取少许混合病料放入研磨器，研磨后取上清液1.5 mL，6700 g离心3 min。应用Trizol试剂提取组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。取2 μL RNA作为模板，按照PrimeScriptTMII试剂盒(大连宝生物公司产品)方法，使用随机六聚体寡核苷酸引物进行反转录合成第一链cDNA，随后取反转录产物做PCR扩增。PRRSV上游引物为5′-ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3′，下游引物为5′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3′，参照浙江省高致病性蓝耳病诊断地方标准合成。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循环35次，72 ℃充分延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，若有必要，进一步测定其核酸序列。

1.2.3 支原体基因片段的PCR扩增及测序分析取2 μL组织研磨上清作为模板直接进行PCR扩增，具体方法与步骤1.2.2类似，但退火温度设置为55 ℃。所用支原体上游引物：5′-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3′，下游引物：

5′-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3′[4]。琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，回收目的条带并做TA克隆、转化和测序分析。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态特征、生化特性和16S rRNA基因特性 病料划线接种于血琼脂平板，形成大量散在的溶血性菌落，转种后仍形成凸起、白色、圆形、光滑的β溶血菌落(图1A)，在高盐培养基上也形成白色菌落(图略)，在LB液体培养基中呈浑浊状生长(图1B)；在光学显微镜下可见成片状或成双排列的革兰阳性球菌(图1C)。该菌株分解葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇，可耐受6.5% NaCl，不分解麦芽糖、棉籽糖、蕈糖、七叶苷、水杨苷、VP和PYR，不还原硝酸盐，触酶试验为阴性。该菌株16S rRNA基因扩增产物呈单一条带，经测序确认该扩增片段长度为1542 bp(图2)。BLAST结果显示与该分离株16S rRNA基因片段同源性最高的细菌为脲气球菌(94%)，但未达到通常判定为同一个种的标准(97%以上的同源性)。

2.2 病料PRRSV基因RT-PCR扩增结果 琼脂糖凝胶电泳显示特异性扩增产物大小接近400 bp(图3)，随后经对PCR扩增产物测序证实为421 bp，即与高致病性PRRSV毒株特有的核酸片段相符，而非美洲型PRRSV毒株具有的511 bp。

A. 菌落形态(血琼脂)；B. 液体培养(LB培养基)；C. 革兰染色(1000×)图1 分离菌株的形态特征

M．DL 2000 DNA参照物；1．16S rRNA基因PCR扩增产物(1542 bp)图2 分离菌株16SrRNA 基因PCR扩增产物凝胶电泳检查

2.3 病料支原体的PCR扩增与基因序列分析结果 琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物特异，对其克隆测序发现大小为267 bp(图4)，核酸序列与猪鼻支原体的同源性达99%。

M．DL1000 DNA参照物；1．PRRSV的RT-PCR扩增产物(421 bp)图3 PRRSV的RT-PCR扩增产物凝胶电泳检查

3 讨论与结论

当前，猪呼吸道疾病以PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征最为严重，临床可见发热、厌食、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔以及仔猪的呼吸道症状[5]。近年来云南省猪蓝耳病的发病率也明显呈上升趋势[6]，本次试验从采集自滇南某规模化养猪场病料中直接扩增出高致病性PRRSV特有核酸片段。与经典PRRSV相比，高致病性PRRSV对猪的致病性更强，可引起所有日龄猪发病和死亡，这应该是导致该猪场死亡率高的主要原因。PRRSV专门感染猪单核-巨噬细胞，能够导致免疫抑制，易使猪出现继发感染，常伴发细菌感染是其一大特征[7-9]，这些病原菌可能是副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎防线杆菌、链球菌、猪肺炎支原体等。本试验应用PCR技术，从所采集病料中直接扩增出支原体特异性核酸片段，经测序分析为猪鼻支原体(MHR)。MHR是引起猪浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等疾病的主要病原体，会造成严重的猪呼吸道综合征，导致断奶仔猪的死亡率增加[10]。2006年我国台湾学者Lin等[11]报道，猪鼻支原体是引起猪地方性肺炎(SEP)的主要病原之一，是猪呼吸道疾病的第2位病原体[12]。本试验成功鉴定出猪鼻支原体，支持该猪场至少存在PRRSV与支原体混合感染的前期临床诊断结果。MHR与PRRSV的混合感染会加重猪的肺炎[13-15]，使得猪群临床发病情况变的尤为复杂，这也是该猪场的主要病因所在。

M．DL1000 DNA参照物；1．支原体PCR扩增产物(267 bp)图4 支原体PCR扩增产物凝胶电泳检查

通常，肺脏虾肉样病变被视为肺炎支原体(MHP)引起的猪气喘病特征性病变，但本试验从病料中并未检出肺炎支原体，而是检测到猪鼻支原体，提示除猪肺炎支原体外，猪鼻支原体目前已成为危害养猪业的又一重要因素。有研究表明，目前PRRSV与MHR的混合感染率要高于其与MHP的混合感染。而且在某种程度上支原体的感染应该能够促进PRRSV的感染和传播。随着猪群的集约化、规模化饲养模式发展，多病原混合感染日趋严重，这一点必须引起我们的高度重视。

本试验从病死猪脾脏中直接分离培养出具有溶血能力的细菌，随后通过16S rRNA基因分析将其鉴定为类脲气球菌。由于溶血性是致病菌常见的一个重要特性，本试验所获类脲气球菌可能是一种新的猪源致病菌或机会致病菌，相关细节方面有待深入研究。关于脲气球菌致病性的研究甚少，这类细菌主要源于尿液，会导致人尿道炎和心内膜炎[16]。对该养猪场走访发现，粪便清理和日常消毒工作不够完善，在PRRSV引起免疫抑制的情况下，出现这类细菌的感染完全是有可能的。

回顾此次被调查猪场发生疫病的过程，得知该猪场在从昆明引入一批种猪前，其自繁自养的猪群来自广西，且未发生过类似严重疾病，提示引起该次疫病的高致病性PRRSV毒株由昆明引入的种猪携带。另发现，这次疫病中成年猪患病率低，可能是之前接种过相应疫苗，仅表现为病毒携带者。遗憾的是，目前尚无有效区别自然感染PRRSV和接种PRRSV减毒疫苗的血清学方法。建议该养殖场淘汰整个猪群，经过休养期后，在再次引进猪只或种猪时，做严格的隔离饲养和检疫，针对不同来源或年龄阶段的猪群，应由专门的饲养员分别负责、独立管理，并保持足够的圈舍间距，或在被引进种猪群中放入数头未人工免疫过的健康仔猪作为“哨兵”动物，混养1～2周，观察无任何传染病发生，即确保种猪健康后，再正式合群。

试验结果表明，该猪群发生以引种携带的高致病性PRRSV毒株感染为主、伴有猪鼻支原体和类脲气球菌混合感染的急性传染病。

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(编辑：李文平)

Etiological Diagnosis of Lethal Respiratory Disease in a Pig Group in South Yunnan Province

ZHENG Yu-fang1, TAO Yong-yan2, YANG Dai-ze1, YANG Chun-yan3, WU Yu-han1, CHEN Pei-fu1**

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China；2.AgricultureCenterofGengmaCounty,Lincang,Yunnan677500,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenter,Chuxiong,Yunnan675000,China)

There was recently an outbreak of lethal respiratory disease in a large-scale pig farm in Honghe Prefecture shortly after breeding pigs were introduced, which was characteristic of fever, diarrhea, dyspnea, the nosebleed before death. It led to a high mortality rate despite of treatment with various drugs, which made it necessary to investigate its etiology in detail. In this experiment, samples including lung, kidneys, spleen and lymph nodes from diseased pigs were collected. The samples were used to inoculate and culture pathogenic bacteria by plate streaking onto the blood agar to form possible hemolytic colonies, followed by high-salt medium culture, Gram staining, biochemical tests for preliminary identification of this isolate. The universal primers for bacterial 16S rRNA genes were then used to amplify its corresponding DNA fragment using PCR technique. The resulting PCR product was recovered by agar gel electrophoresis, and then subjected to TA cloning as well as sequence analysis. Supernatant from milled tissue samples was used to amplify nucleic acid fragments of other potential pathogens by PCR, followed by similar procedure. As a result, the isolated strain displayed positive in Gram staining, utilization of glucose, sucrose, xylose, sorbitol and 6.5% NaCl, but negative in maltose, raffinose, mushroom sugar, esculin, salicin, VP, pyrrolidone, nitrate and catalase test, and gave a specific band with 1542 bp, which had the highest homology (94%) withAerococcusurinae; Single porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) specific 421 bp band and mycoplasma specific 267 bp band were obtained simply by PCR amplification from the tissue samples, respectively, with the former being specific in highly pathogenic PRRSV strains and the latter having a DNA sequence homology up to 99% withMycoplasmahyorhinisSK76 strain. The above results demonstrate that this outbreak of an acute contagious disease was caused mainly by highly pathogenic PRRSV, with mixed infection caused byM.hyorhinisandA.urinae-like bacterium, indicating the importance of intensive emphasis on potential risk of PRRSV carrying in introduced animals.

PRRSV;Mycoplasmahyorhinis;Aerococusurinae-like organism; mixed infection; PCR

云南省高校兽医公共卫生重点实验室(A3007954)；云南省现代农业生猪产业技术体系建设(云财农[2009]171号)

郑玉芳，硕士研究生，从事预防兽医学研究。陶永艳，兽医师，为共同第一作者。

陈培富。E-mail：cltwins2003@sina.com

2016-10-11

A

1002-1280 (2017) 01-0006-06

S858.28