不同种类植物油及黄豆饼粉对那西肽发酵的影响

李巧亮，张萍，牛春

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川 750101)

不同种类植物油及黄豆饼粉对那西肽发酵的影响

李巧亮，张萍，牛春*

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川 750101)

有机氮源和碳源质量的波动是引起那西肽发酵单位波动的重要原因之一，为选用最有效的有机氮源和碳源生产那西肽并保持稳定的发酵水平，试验以发酵摇瓶平均化学效价为指标，比较及评价了6种不同种类植物油及4种不同加工温度生产的黄豆饼粉对那西肽发酵产生的影响。结果表明，低温黄豆饼粉-菜籽油为最佳组合，其摇瓶平均化学效价比对照高出44.11%。即不同种类植物油由于所含脂肪酸种类和比例不同，不同加工温度的黄豆饼粉由于营养物质含量不同，均会很大程度影响那西肽发酵。

那西肽；植物油；黄豆饼粉；效价

那西肽(Nosiheptide)，又称诺西肽(Multithiomycin)，是含硫多肽类抗生素，目前一般采用活跃链霉菌(Streptomycesactuosus)发酵产生[1]。对革兰氏阳性菌有良好的抑菌效果[2]，可以促进牲畜生长，提高饲料利用率，具有用量少、无药物残留、毒性小、对环境影响小等特点[3]，被批准为我国国家三类新兽药。作为那西肽发酵的有机氮源，蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉效果都较好，但从生产的经济性、可行性考虑，黄豆饼粉则为最佳选择。它是发酵液中发泡的主要因素，产生的泡沫多而持久，使发酵液粘度很大。不同产地、不同加工温度、不同储存条件的黄豆饼粉质量相差很大[4]。植物油在抗生素发酵过程中充当着氧载体、消沫剂、碳源，能够显著提高抗生素产量。油脂具有疏水性，微溶于水，因而可以作为缓慢利用碳源，避免因碳源的迅速利用而引起的分解代谢物阻遏作用[5]。油脂作为碳源被利用，主要是脂肪酸发挥作用[6]。不同植物油由于脂肪酸含量和种类、生产原料、生产季节、提取方法、储存条件不同，质量也存在很大差异。然而二者对发酵生产的影响是多尺度并存在交互作用的，宏观上影响着最大菌丝浓度、氨氮代谢、糖代谢、发酵周期、发酵效价等工艺参数，微观上对菌丝生长、菌丝结构、初级代谢向次级代谢转换等均有重要影响[7]。为初步探究二者影响那西肽发酵的机理、降低成本、提高生产水平，本文比较了不同种类植物油及不同加工温度生产的黄豆饼粉对那西肽发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 活跃链霉菌(Streptomycesactuosus)，经宁夏泰瑞制药股份有限公司自然分离筛选得到的高产、传代稳定的菌株：RNX15-92，单菌落直径3～5 mm，灰白色，礼帽型，低温管保藏。

1.1.2 主要设备 旋转摇瓶机，XDW25/96型，四川长征制药机械厂；紫外可见分光光度计，UV-1800，日本岛津；恒温、净化工作系统。

1.1.3 试剂及原料 植物油购自山东青岛菜香花生油有限公司。黄豆饼粉购自石家庄市栾城区华昌化工有限公司，经纯物理压榨加工、粉碎、精致而成，主要区别在于加工温度不同：生磨豆粉为直接磨制、低温豆粉为80 ℃左右蒸炒、中温豆粉为100 ℃左右蒸炒、高温豆粉为130～140 ℃左右蒸炒。无水乙醇、四硼酸钠、硼酸、正丁醇、氢氧化钠等均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 培养基 斜面培养基：口服葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰、玉米浆、试剂碳酸钙、硫酸锌、氯化铜、氯化钴、琼脂，纯化水定容，pH 7.00，50/250 mL茄瓶分装，120～121 ℃、0.10～0.11 MPa高压蒸汽灭菌30 min。种瓶培养基：蔗糖、硫酸铵、蛋白胨、玉米浆、轻质碳酸钙，自来水定容，pH 6.50，50/250 mL三角瓶分装，120～121℃、0.10～0.11 MPa高压蒸汽灭菌30 min。发酵培养基：玉米淀粉、淀粉酶、黄豆饼粉、乳化剂np-30、硫酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、轻质碳酸钙、植物油，自来水定容，50/250 mL三角瓶分装，pH 7.00，120～121 ℃、0.10～0.11 MPa高压蒸汽灭菌30 min。

1.2.2 培养方法 挖取新鲜斜面约1.5 cm2接种至种瓶培养基中并捣碎，培养温度29 ℃，湿度20%～30%，转速240 r/min，置摇瓶机震荡培养30 h。将种子液以7%的接种量转至发酵瓶培养基，培养温度29 ℃，湿度20%～30%，转速240 r/min，置摇瓶机震荡培养232～240 h结束，测定发酵液的pH、总糖、氨基氮、化学效价。

1.2.3 单因素实验 每批发酵瓶中添加不同种类植物油，以不加植物油为对照。生磨、低温、中温、高温分别代表不同加工温度生产的黄豆饼粉。分别进行植物油及黄豆饼粉的单因素实验，每批实验重复三次，每次设置三个平行样同时发酵。

1.2.4 交互作用实验 选取2种效价最高的植物油，与2种效价最高的黄豆饼粉进行交互作用实验，验证它们之间是否有交互作用。

1.2.5 验证实验 将效价最高的组合与不加植物油-效价最低黄豆饼粉组合做对比，验证其组合效果。1.2.6 那西肽的含量测定 从发酵摇瓶中吸取2.5 mL发酵液于25 mL比色管中，加入7.5 mL无水乙醇，加盖，充分摇匀，于39 ℃恒温水浴锅保温30 min，过滤，吸取1 mL上清液，加入10 mL硼砂缓冲液和8 mL正丁醇溶液，充分摇匀，放入39 ℃恒温水浴锅保温20 min，吸取4 mL上层液体与4 mL无水乙醇混合，摇匀，408 nm处测定A值。效价=A×稀释倍数×1000。发酵液中总糖、氨基氮含量的测定分别采用斐林试剂法和甲醛法[8]。相对标准偏差RSD(%)用EXCEL统计函数STDEV计算[9]。

2 结果与分析

2.1 不同加工温度的黄豆饼粉对发酵摇瓶效价的影响 如图1所示。由图1可得不同加工温度的黄豆饼粉对那西肽发酵效价有很大影响。黄豆饼粉种类不同，发酵效价差别显著，效价从高到低的顺序依次为：低温黄豆饼粉>生磨黄豆饼粉>中温黄豆饼粉>高温黄豆饼粉。低温黄豆饼粉比生磨、中温、高温黄豆饼粉的发酵效价分别高出1.53%、25.93%和38.87%。

图1 不同加工温度的黄豆饼粉对发酵摇瓶效价的影响

2.2 低温黄豆饼粉对发酵液中氨基氮含量和pH的影响 如图2所示。从图2可以看出，氨基氮在整个发酵过程中的变化表现为：早期40 h有所升高，原因可能是大分子有机氮源被分解，释放出较多的氨基酸，然后逐渐下降，在88 h降至最低，112～184 h菌体次级代谢活跃，氮源的分解产生了大量的含氮化合物，使氨基氮缓慢上升，184 h以后营养成分不足引起菌体自溶，因此氨基氮的量迅速增加，发酵结束时达到峰值。

图2 低温黄豆饼粉发酵液中氨基氮含量和pH变化曲线

从图2中可以看出，随着菌体的生长和代谢，pH变化呈S形波动趋势，即先下降，后升高。菌体的生长与合成代谢产物的相对pH有所不同：菌体生长阶段pH范围约为6.65～6.96，此时菌种具有最大的比生长速率；菌体代谢阶段pH约为7.37～7.46，此时那西肽合成效价最高；菌体自溶阶段pH约为8.32～8.84，此时菌体快速溶解，发酵结束。

实验同时测定了四种黄豆饼粉发酵结束时发酵液中氨基氮的最终含量，三组实验，三个平行，结果如表1，可以发现效价最高的黄豆饼粉，氨基氮的最终含量也最高。说明低温黄豆饼粉可以更好的被菌体利用，积累大量的菌丝，菌浓的增加使抗生素合成总量加大，从而提高发酵效价。

表1 不同种类黄豆饼粉发酵液中氨基氮终含量

2.3 不同种类植物油对发酵摇瓶效价的影响 不同种类植物油对那西肽效价影响结果如图3所示。由图3可知，植物油种类不同，那西肽效价也有很大差异，其效果从高到低依次为：菜籽油>大豆油>玉米油>花生油>橄榄油>芝麻油。在实验过程中发现，植物油的加入对那西肽的合成、发酵液外观都有很大影响。和不加植物油的对照相比，当添加植物油后，发酵摇瓶的泡沫显著减少，颜色更偏黄绿色，效价显著提高。实验可以证明菌种脂肪酶活性较强，在发酵的某阶段，可将植物油分解成甘油和脂肪酸，然后脂肪再经氧化分解，参与菌体代谢。

图3 不同种类植物油对发酵摇瓶效价的影响

2.4 不同种类植物油对发酵液pH的影响 不同种类植物油对发酵摇瓶pH的影响如图4所示。从图4中可以看出，不加植物油的对照组，pH变化大，不能有效的使发酵液的酸碱度维持在适合菌种生长和代谢的环境。而在发酵培养基中添加不同种类的植物油以后，对发酵过程中pH的稳定能起到很大作用。

图4 不同种类植物油对发酵摇瓶pH的影响

2.5 不同种类植物油对发酵液总糖含量的影响

图5 不同种类植物油发酵液中总糖含量变化曲线

不同种类植物油对发酵液总糖含量的影响如图5所示。从图中可以看出，在发酵前期，菌体快速生长，糖被快速消耗，菌体大量繁殖；发酵中期菌丝成网且形成菌核，那西肽迅速产生，此时总糖的量也接近最低水平；至发酵后期，菌丝和菌体自溶，总糖含量略有升高。这一过程符合抗生素发酵的一般规律。

实验同时测定了四种效价较高植物油发酵结束时发酵液中总糖含量(表2)，发现植物油效价越高，发酵液总糖终含量越低。说明植物油效价越高，糖被利用的越彻底，效价越高。

表2 不同种类植物油发酵液中总糖最终含量

2.6 交互作用实验 在实验中发现，黄豆饼粉和植物油的组合种类不同，发酵摇瓶效价也有很大差别，即二者之间有交互作用。因此进行了二者的交互作用实验，并得出了一定规律，具体结果如表3所示。从表3中可以看出，当使用生磨豆饼粉时，3次实验结果都是添加豆油的效价高于添加菜籽油的效价；而当使用低温豆饼粉时，3次实验结果都是添加菜籽油的效价高于添加豆油的效价；且低温黄豆饼粉-菜籽油组合效价最高，确定为最佳组合。

表3 交互作用实验

2.7 验证实验 将最佳组合低温黄豆饼粉-菜籽油与高温黄豆饼粉-不加植物油组合做对比，此组合平均效价可以达到5789 U/mL，和对照4017 U/mL相比，发酵摇瓶效价提高了44.11%，效果非常显著(图6)。

图6 验证实验

3 讨论与小结

pH是那西肽发酵生长和产物合成非常重要的工艺参数，是代谢活动的综合指标。菌种在发酵过程中，pH变化会影响基质利用速率、各种酶活和细胞结构，从而影响菌体生长和产物合成。速效氮源的使用会造成培养基的pH偏高，对菌体生长不利；而有机氮源营养丰富，且菌体本身含有丰富的蛋白酶系，可以持续对其分解利用，且生长过程中始终能使培养基的pH保持相对稳定，对菌体生长有利[10]。黄豆饼粉的主要区别在于加工温度不同，从而蛋白、脂肪、水份、灰份和酸价等指标均存在显著差异，低温黄豆饼粉水份、蛋白、脂肪和灰份含量分别为≤12%、≥41%、≤10%、≤8%，而高温黄豆饼粉则分别为≤8%、≥40%、≤8%、≤10%[11]，即黄豆饼粉蛋白、水份和脂肪含量越高，灰份含量越低，越有利于稳定摇瓶发酵过程中的pH和提高最终平均化学效价。黄豆饼粉亦是发酵液中发泡的主要因素，产生的泡沫多而持久，使发酵液粘度很大。而植物油作为消沫剂，可以很好的解决这一问题。添加植物油之后，摇瓶发酵液泡沫会显著减少。

油脂的主要成分是碳原子数量不同的短链和长链脂肪酸，主要是C-12、C-16、C-18脂肪酸。如大豆油主要含有硬脂酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸等；菜籽油除了含有以上主要成份外，还含有芥酸[12]。而芝麻油的成份则比较简单，根据不同植物油中脂肪酸种类和比例的不同结合实验结果，可得不同种类植物油对那西肽效价产生不同影响的原因可能有以下两点：一是脂肪酸组成的复杂性造成的，即植物油所含脂肪酸种类越复杂，那西肽的发酵效价就越高；二是饱和和不饱和脂肪酸的比例造成的，即不饱和脂肪酸和那西肽效价呈正相关关系[13]。

不同产地、不同加工温度、不同储存条件的黄豆饼粉质量相差很大。不同植物油由于脂肪酸含量和种类、生产原料、生产季节、提取方法、储存条件不同，质量也存在很大差异。本文对原材料加工方法、品种等相关条件进行了试验及分析，有效避免了因碳源和氮源质量波动而引起的那西肽发酵pH和生产效价波动，亦改善了发酵泡沫引起的染菌等问题，显著提高了发酵水平，对于那西肽的生产具有指导意义。

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(编辑：侯向辉)

Effect of Vegetable Oils and Soybean Powder on Nosiheptide Fermentation

LI Qiao-Liang, ZHANG Ping, NIU Chun*

(NingxiatairuiPharmaceuticalCoLtdStrainsInstitute,Yinchuan750101,China)

The titer of nosiheptide in the shake flask was significantly influced by the quality of organic nitrogens and carbon sources. In this paper we compeared and evaluated the influence of six kinds of vegetable oils and four kinds of soybean powder pruduced by different processing temperatures, in order to maintain a stable level and select the most effective organic nitrogen and carbon sources by the average titer of nosiheptide in the shake flask. The results showed that low temperature soybean and rapeseed was the best combinationl, the average titer of nosiheptide in the shake flask was 44.11% higher than the contrast. So the average titer of nosiheptide in the shake flask was significantly influced by the nutrient contents of soybean powder and different percentages of fatty acids in vegetable oils.

nosiheptide; vegetable oils; soybean powder; titer

李巧亮，研究生，从事菌种生产和研究。

牛春。E-mail: niuchun1974@163.com

2016-08-04

A

1002-1280 (2017) 01-0025-05

S859.796