外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清的制备与检定

孙淼，李岭，李启红，李慧姣，李俊平，杨承槐

(中国兽医药品监察所，北京100081)



外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清的制备与检定

孙淼，李岭，李启红，李慧姣，李俊平*，杨承槐*

(中国兽医药品监察所，北京100081)

为制备外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)的特异性血清，对300只3～4周龄的SPF鸡进行了基础免疫和加强免疫。最后一次免疫后21d采血并分离血清，血清经混合、分装、冷冻真空干燥后，对其进行了无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验。结果表明，本研究制备的抗IBDV特异性血清无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定均符合《中华人民共和国兽药典》三部(二〇一〇年版)规定；血清中和效价为1:5747，与IBDV B87株毒种中和指数为104.3，与鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、鸡传染性支气管炎病毒H52株、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、禽呼肠孤病毒S1133株的中和指数均不大于10，通过AGP、ELISA、HI等试验确定血清中不含其他禽源外源病毒抗体。本研究为鸡传染性法氏囊病活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清。

鸡传染性法氏囊病；特异性血清；检验

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种侵害禽类的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性疾病[1]。免疫接种是控制IBD的主要方法[2]，近年来随着鸡传染性法氏囊病疫苗的不断发展，已出现多种不同毒株的IBD活疫苗，如B87株、W2512株、Gt株等。根据《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)[3]规定，IBD活疫苗或毒种必须进行外源病毒检验，此项检验需用抗IBDV特异性血清对样品进行中和。因此，抗血清的中和效价和特异性对检验起着至关重要的作用。由于市场上缺乏能够满足兽用生物制品生产企业检验需求的IBD特异性抗血清，因此，本研究优化了免疫条件，利用IBD活疫苗进行基础免疫，并用IBD灭活疫苗进行加强免疫，制备了1批抗IBDV特异性血清并对其纯净性、中和效价及特异性进行鉴定，为生物制品厂家开展IBD活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了物质保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒种 IBDV B87株；鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)La Sota株；鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Disease Virus, IBV)H120株、H52株；鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Disease Virus, ILTV)、鸡痘病毒(Avian Pox Virus, APV)、禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus, ReoV)S1133株均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

1.1.2 SPF鸡胚和鸡 均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.3 试剂和试剂盒 NDV红细胞凝集抑制试验抗原、减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus, EDSV)红细胞凝集抑制试验抗原、鸡马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus, MDV)琼脂凝胶扩散试验抗原、APV琼脂凝胶扩散试验抗原均由中国兽医药品监察所制备、提供；禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H5、H9亚型红细胞凝集抑制试验抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

ILTV抗体检测试剂盒购自Biocheck公司；IBV、ReoV、禽网状内皮组织增生症病毒(Avian Reticuloendotheliosis Virus, REV)、鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus, CIAV)、禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)、禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)(A、B亚群)抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 IBDV B87株繁殖及灭活抗原乳剂的制备均参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)[4]。

1.2.2 免疫程序 取3～4周龄SPF鸡300只，用IBDV B87株活疫苗进行基础免疫，再用IBDV B87株油乳剂灭活疫苗进行加强免疫3～4次。

1.2.3 血清采集与分离 最后一次免疫后21 d，所有鸡心脏采血，分离血清。

1.2.4 组批分装 将血清混合、分装，每瓶2 mL，参照《中国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)进行冷冻真空干燥。

1.2.5 无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定 按《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)进行。

1.2.6 中和效价测定 将抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清用灭菌生理盐水进行2倍系列稀释，分别与等体积的IBDV B87株病毒液(100ELD50/0.1 mL)混合，室温(18～24 ℃)作用1 h，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚0.2 mL；同时设病毒对照5枚，每胚接种病毒液0.1 mL。置37 ℃孵育7 d，每日照蛋，记录鸡胚死亡情况，按Reed-Muench法计算中和效价。

1.2.7 特异性检验1.2.7.1 交叉中和试验 将IBDV B87株、NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV、ReoVS1133株毒种做10倍系列稀释，分别放入2列试管中。第一组取适宜的稀释度加入等量的抗IBDV特异性血清，另一组加入等量的阴性血清，室温作用1 h后，经尿囊腔(绒毛尿囊膜)接种9～11日龄SPF鸡胚，置37 ℃孵育适宜时间后，计算中和指数。

1.2.7.2 抗体检测 将抗IBDV特异性血清按照表1中列出的检验方法对NDV、APV、ILTV、IBV、ReoV、REV、CIAV、EDSV、MDV、AEV、AIV(H5、H9亚型)和ALV(A、B亚群)抗体进行检测。

表1 病原抗体及其检验方法

注：HI=红细胞凝集抑制试验；AGP=琼脂凝胶扩散试验；ELISA=酶联免疫吸附试验

1.2.8 应用 按照《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)，应用本研究制备的抗IBDV特异性血清，分别与IBDV种毒、IBD活疫苗进行中和试验和外源病毒检验。

1.2.8.1 IBDV B87株种毒中和试验 将IBDV B87株种毒稀释至500×103.0ELD50/2 mL(即相当于500羽份IBD活疫苗)，取2 mL与等体积的4倍、8倍、16倍稀释血清混合，37 ℃中和1 h，分别接种鸡胚成纤维细胞和10日龄SPF鸡胚，进行中和试验。

1.2.8.2 3批IBD活疫苗(B87株)外源病毒检验 按照《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)，将3批疫苗样品分别稀释至500羽份/2 mL，与等体积的抗IBDV特异性血清混合，37 ℃中和1 h，分别接种鸡胚成纤维细胞和10日龄SPF鸡胚，进行外源病毒检验。

2 结果与分析

2.1 无菌检验 从冻干的抗IBDV特异性血清中随机选取5瓶进行无菌检验，均无菌生长，符合《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)规定。

2.2 外源病毒检验 从冻干的抗IBDV特异性血清中随机选取3瓶进行外源病毒检验，无外源病毒污染，符合《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)规定。

2.3 剩余水分测定 从冻干的抗IBDV特异性血清中随机选取4瓶进行剩余水分测定，含量分别为1.9%、2.1%、2.0%、2.1%，符合《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)规定。

2.4 中和效价测定 如表2所示，用IBDV B87株进行基础免疫，再用IBDV B87株油乳剂灭活疫苗进行加强免疫，制备了1批抗IBDV特异性血清共8000 mL。本血清的中和效价为1:5747。

表2 抗IBDV特异性血清中和效价测定结果

2.5 特异性

2.5.1 交叉中和试验 如表3中所示，将抗IBDV特异性血清与IBDV B87株进行中和试验，中和指数为104.3；而与NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV、ReoVS1133株的中和指数均不大于10。

表3 抗IBDV特异性血清交叉中和试验结果

2.5.2 抗体检测 经HI、AGP、ELISA方法检测，本研究制备的抗IBDV特异性血清不含NDV抗体、APV抗体、ILTV抗体、IBV抗体、ReoV抗体、REV抗体、CIAV抗体、EDSV抗体、MDV抗体、AEV抗体、AIV(H5、H9亚型)抗体和ALV(A、B亚群)抗体。结果表明，本血清具有良好的特异性。

2.6 应用

2.6.1 IBDV B87株种毒中和试验 中和试验结果表明，本研究制备的抗IBDV特异性血清8倍稀释后能够完全中和500×103.0ELD50的病毒。

2.6.2 3批IBD活疫苗(B87株)外源病毒检验 3批疫苗样品的外源病毒检验结果均为阴性，说明2mL抗IBDV特异性血清能够完全中和每批次各500羽份的疫苗样品。

3 讨论与小结

按照《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)要求，鸡传染性法氏囊病活疫苗或毒种必须进行外源病毒检验。外源病毒检验需将IBD活疫苗或毒种稀释成500羽份/2 mL或5×104.0ELD50/0.1 mL，然后与等量抗血清中和。这要求抗血清应具有良好的特异性和高效价。

章振华等[5]制备了IBDV抗血清并对其进行了检验。本实验室利用多年积累的经验，优化了免疫方法，最终制备了8000 mL抗血清。按照《中国兽药典》三部(二〇一〇年版)对血清进行了无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定，结果均符合规定，确保了血清的纯净性。为了保证抗血清的单特异性，基础免疫和加强免疫的疫苗均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存的IBDV 87株毒种制备，该毒种均严格按照《中国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)进行了鉴定，纯净无细菌、支原体或其他外源病毒污染，有效避免了采用商品化疫苗进行免疫，污染外界病原微生物的可能。本研究在首次免疫前对使用的SPF鸡进行了血清抗体筛查，确保无外源病毒感染。所有SPF鸡均饲养在位于10000级屏障系统的专用隔离器中，由专人饲喂管理。保证环境洁净的同时，与SPF鸡所接触的一切，包括饮用水、空气、饲料、接触的人员和物品，都必须进行严格的微生物控制。除此之外，还建立了完善的消毒及卫生防疫措施，确保在整个实验过程中不会污染外界病原微生物，影响抗血清的特异性。

为了提高抗血清的中和效价，本研究采用活疫苗进行基础免疫，然后用灭活疫苗间隔不同时间进行多次加强免疫，促使机体免疫系统持续产生高效价的抗体。章振华等制备的抗血清，仅对NDV、IBV、AIV(H9亚型)和EDSV进行了特异性检验，而本研究采用两种试验方法对IBDV抗血清进行了特异性检验，涵盖了13种禽源病毒抗体的检测。交叉中和试验结果表明，本抗血清与IBDV B87株的中和指数为104.3而与NDV La Sota株、IBV H120株、IBV H52株、ILTV、APV和ReoVS1133株的中和指数均不大于10；经HI、AGP、ELISA方法检测，NDV抗体、APV抗体、ILTV抗体、IBV抗体、ReoV抗体、REV抗体、CIAV抗体、EDSV抗体、MDV抗体、AEV抗体、AIV(H5、H9亚型)抗体和ALV(A、B亚群)抗体均为阴性，说明本研究制备的IBDV抗血清具有良好的特异性。血清中和效价为1:5747，8倍稀释后每0.1 mL血清能中和104.7ELD50的IBDV B87株(50羽份)病毒，即1 mL血清能中和500羽份的病毒。应用于外源病毒检验时，3批疫苗样品的病毒含量分别为104.5ELD50/羽份、104.4ELD50/羽份、103.2ELD50/羽份，即1 mL血清能够中和至少5×106.5ELD50的疫苗样品。

[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].第二版.北京：科学出版社,1997:582-587.

[2] Y.M.Saif.禽病学[M].第12版.北京：中国农业出版社，2012:210-239.

[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典三部(二〇一〇年版)[M].北京：中国农业出版社，2011:45-46.

[4] 农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程(二〇〇〇年版)[M].北京：科学出版社，2000:231-233.

[5] 章振华，李林，姜北宇，等.鸡传染性法氏囊病高免血清的制备与检验[J].安徽农业科学，2012，40(11):6529-6530.

(编辑：侯向辉)

Preparation and Identification of Specific Antiserum against Infectious Bursal Disease Virus for Exogenous Virus Test

SUN Miao, LI Ling,LI Qi-hong, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, YANG Cheng-huai*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China)

To prepare the specific antiserum against Infectious Bursal Disease Virus (IBDV)for exogenous virus test, 300 SPF chickens with 3～4 weeks old were inoculated with IBD live vaccine and inactivated vaccine. 21 days after the last immunity, serums were collected and mixed thoroughly. After lyophilization, the serum was used for sterility test, exogenous virus test, residual moisture test, neutralization titer determination and specific inspection. The results of sterility test, exogenous virus test and residual moisture test complied with China veterinary pharmacopoeia.Theneutralization titer was 1:5747. The cross neutralization index of the serum induced by IBDV B87 was 104.3, while below 10 induced by other avian viruses. There were no antibodies against other avian disease viruses in this serum, using APG, ELISA and HI test.Antiserum against IBDV was prepared with high specificity and neutralization titer for the identify inspection and exogenous virus test of IBD live vaccines and virus seeds.

infectious bursal disease virus; specific antiserum; test

孙淼，助理研究员，从事动物生物制品检验及相关研究。

李俊平。E-mail:lijunping03@163.com；杨承槐。E-mail:ychenghuai@163.com

2015-06-08

A

1002-1280 (2015) 09-0011-04

S852.65