庆大霉素标准品制备中效价测定及原材料选择的研究

韩宁宁，徐嫄，于丽娜，郝利华，赵晖

(中国兽医药品监察所，北京100081)



庆大霉素标准品制备中效价测定及原材料选择的研究

韩宁宁，徐嫄，于丽娜，郝利华，赵晖*

(中国兽医药品监察所，北京100081)

在近期庆大霉素标准品制备过程中遇到两个问题——双圈与可靠性测验不符合规定。通过调整菌悬液浓度、抗生素浓度及上层菌液加入量使双圈现象得以抑制，以保证测量结果准确可靠。C组分测定结果显示原料药与标准品C组分差异较大，容易导致二者剂量反应直线不平行，进而影响可靠性测验结果。通过更换与标准品C组分更为相近的原料药使可靠性测验符合规定。上述改进措施保证了国家标准品赋值的准确性，以期为同业人员效价测定遇到类似问题提供借鉴。

庆大霉素；C组分；双圈；三剂量法；可靠性测验

庆大霉素(gentamicin，GM)是由小单孢菌属(Micromonosporapurpurea)发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖苷类抗生素，它们在结构上是由脱氧链霉胺(purposamine)、紫素胺和3-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺缩合成的苷。临床上使用的庆大霉素主要由Cl、Cla、C2、C2a四个活性成分组成，另外还有其他几个微量组分，如西索米星(sisomicin)、庆大霉素C2b(也称为沙加霉素，sagalnicin)、二-氢氧-庆大霉素C2a(Antibiotic JI-20 B，它是Cl、C2和C2a的前导物)等[1-2]。多组分抗生素对检定菌抑菌作用存在差异，易发生双圈现象，在兽药典抗生素微生物检定法[3]规定范围内，通过调整菌浓、加菌量、加药量等措施可使双圈得以抑制。原料药与标准品组分差异较大时，易导致二者剂量反应直线不平行，进而影响可靠性测验结果。通过更换与标准品组分更为相近的原料药，可使可靠性测验结果符合规定。近期，在庆大霉素标准品换批制备过程中，遇到了上述两个问题，通过相应改进措施使问题得以解决。

1 材料与方法

1.1 仪器材料与试药 抗生素效价测量仪(北京潮声技术开发公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。抗生素I号培养基、pH值7.8的磷酸盐缓冲液及灭菌水均由中国兽医药品监察所中海公司提供；庆大霉素标准品及检定菌CMCC(B)63202冻干管购于中国食品药品检定研究院。庆大霉素标准品批号130326-201015，效价630单位/mg。1.2 双圈现象的解决方法 在效价测定条件摸索阶段，发现菌碟双圈现象极为严重，甚至出现了三圈或四圈的情况。为尽量减小双圈现象对效价测量的影响，采取了调整菌悬液浓度、抗生素浓度及上层菌液加入量等措施。将优化前后条件总结如表1。

表1 效价测定方法优化前后条件对比表

1.3 可靠性测验不符合规定的解决方法 《中国兽药典》二〇一〇年版附录生物检定统计法[3]对三剂量法效价测定可靠性测验的如下4个参数进行了规定：回归需具有显著性差异(即P<0.01)，偏离平行、二次曲线及反二次曲线均需不具有显著性差异(即P>0.05)。然而，在对该批原料药进行效价赋值时，总是存在偏离平行、二次曲线或反二次曲线中的一项或两项甚至三项不符合规定的情况。为避免人员个体误差的干扰，更换检验员进行了重复试验；为避免方法误差的干扰，采用浊度法代替管碟法进行了测定。然而，无论如何改进，上述问题仍然存在。怀疑可能是由于该批原料药与标准品的组分差异过大，导致二者具有明显异质性，从而影响了可靠性测验结果。因此重新购买了一批原料药，并根据《中国兽药典》二〇一〇年版硫酸庆大霉素[3]的方法对这2批原料药的C组分进行了测定与比较。然后根据药典方法对这两批原料药进行了效价测定与可靠性测验分析。最终选择了与标准品C组分更为相近的一批原料药作为本次标准品制备的原料。

2 结果与分析

2.1 条件改进前后抑菌圈效果对比 提高菌悬液浓度和降低抗生素浓度都可以起到减小抑菌圈直径的作用。而直径减小必然导致各层菌圈间距缩小，甚至可能出现菌层生长速度加快外圈将内圈覆盖的现象，从而起到抑制双圈的作用。减少上层菌液加入量可以使抑菌圈投射在培养基最上层的环形扩散面积减小。图1为抗生素抑菌圈球形扩散模式图，如图所示，当菌层越薄时，投射在最上层的环形面积越小，抑菌圈越接近于圆形，即双圈现象越不明显。改进前后，测得的高剂量抑菌圈直径均在药典规定的范围[3](18～22mm)内，而改进后双圈现象明显改善，如图2～图3。

图1 抗生素抑菌圈球形扩散模式图

图2 条件改进前庆大霉素抑菌圈效果图

图3 条件改进后庆大霉素抑菌圈效果图

2.2 批原料药C组分测定及效价测定结果比较 如表2所示，与标准品相比，原料药1的C1a相差4.8%，C1相差4.3%，C2和C2a加和相差9.0%。也就是说，原料药1虽然符合药典关于C组分的规定，但是与标准品均质性差异较大。

与标准品相比，原料药2的C1a和C1分别仅有2.5%和1.4%的差异，C2和C2a虽然差异为5.5%和4.6%，但二者加和(46.6%)与标准品(47.5%)仅差0.9%，且二者对庆大霉素效价贡献几乎相同，因此对其均质性影响不大。

采用药典方法对2批原料药进行了效价测定，结果原料药2可靠性测验均符合规定，见表3。

3 讨论

3.1 双圈问题的原因与解决措施 如前言所述，庆大霉素为多组分抗生素，不同组分对药物效价的贡献有差异，其对检定菌抑菌作用的差异在菌碟上表现为抑菌圈大小不一致，因而极容易出现双圈现象。在抑菌圈测量仪上，尽管可以通过调节阈值等参数使仪器尽量读取同一种抑菌圈的直径，但仍存在较大测量误差，这为国家标准品含量赋值的精确性带来了风险。通过调整菌浓、加菌量、加药量等措施可使双圈得以抑制，以保证仪器测定结果准确可靠。

表2 原料药1、2与标准品C组分差异对比

表3 原料药1、2效价测定及可靠性测验结果对比

3.2 组分差异对可靠性测验结果的影响 二〇一〇年版《中国兽药典》[3]及《中国药典》[5]对庆大霉素C组分的规定相同，均为：C1应为25%～50%；C1a应为15%～40%；C2+C2a应为20%～50%。可以看出，药典标准对每种组分相对含量的规定范围是相当宽泛的。杨利红等[4]已研究了庆大霉素4种组分对其效价的贡献，4种组分效价从1287单位/mg至740单位/mg不等。当原料药与标准品C组分差异较大时，由于各组分效价贡献不同，就会导致二者均质性差异大，在效价计算过程中，容易导致二者剂量反应直线不平行，进而导致误差计算过程中出现偏离平行、二次曲线或反二次曲线具有显著性差异的情况。而组分差异限值多少时会导致三剂量法可靠性测验不符合规定？仅据现有数据可知，C2和C2a加和相差9.0%会导致上述问题出现，那么从不具有显著性差异突变到具有显著性差异的限值是多少呢？毫无疑问，这一限值对于日后标准品制备过程中原料药选取是具有指导性意义的。而该限值的获得要基于进一步的多批次原料药C组分数据与效价测定数据的统计。

3.3 如何选择用于制备标准品的原料药 由于供应紧张，本批标准品制备采取了更换与市面标准品更为相近的原料药的做法。实际上，更为合理的做法是，对庆大霉素原料药厂家进行调研与原料收集，将各批原料的C组分数据进行统计，从中选取各组分相对含量位于中值的原料药，以适应市面上大部分庆大霉素原料与制剂的效价测定。

3.4 管碟法效价测定的影响因素 管碟法作为抗生素效价测定的经典方法，操作步骤复杂，影响因素众多[6]。试验菌的活力与浓度、培养基的成分与pH值、缓冲液的成分与pH值、培养环境的无菌程度、培养时间与温度、效价测量仪的精密度与准确度等等都会对测定结果产生影响。各影响因素还可能存在相互影响，相互作用。在效价测定过程中，需对问题产生的原因认真分析，并采取相应对策，就可消除各影响因素产生的误差，提高测定结果的准确性与可靠性。

[1] 王岳, 方金瑞. 抗生素[M]. 北京: 科学出版社, 1988: 294-301.[2] Chissell J F, Freeman M, Loran J S,etal. British pharmacopoeial gentamicin sulfate component ratio test by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr, 1986, 369: 213-217.

[3] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典二〇一〇年版一部[M]. 北京： 中国农业出版社， 2010： 附录121-128， 附录161-184， 294-296.

[4] 杨利红，常艳，姚尚辰，等. HPLC法同时测定庆大霉素的组分纯度和效价活性[J]. 药学学报ActaPharmaceuticaSinica，2012, 47(12)：1660-1666.

[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典二〇一〇年版二部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010:976-977.

[6] 李凡，朱志华，姜凤丽，等.管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进[J].中国兽药杂志，2008,42(1)：45-48.

(编辑：侯向辉)

农业部决定在食品动物中停止使用洛美沙星等4种兽药

(中华人民共和国农业部公告第2292号)

为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，我部组织开展了部分兽药的安全性评价工作。经评价，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，我部决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。现将有关事项公告如下。

一、自本公告发布之日起，除用于非食品动物的产品外，停止受理洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂的兽药产品批准文号的申请。

二、自2015年12月31日起，停止生产用于食品动物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂，涉及的相关企业的兽药产品批准文号同时撤销。2015年12月31日前生产的产品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2016年12月31日起，停止经营、使用用于食品动物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂。

农业部

2015年9月1日

摘自中国兽药信息网

Titer Determination and Selection of Raw Materials for the Preparation of Gentamicin Standard

HAN Ning-ning, XU Yuan, YU Li-na, HAO Li-hua, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

During the preparation of the standard of gentamicin, two problems were encountered——double circles and the reliability test did not confirm to the requirement. The phenomenon of double circle was suppressed by adjusting the concentration of bacterial suspension, the concentration of antibiotics and the amount of the bacteria, in order to ensure the accuracy and reliability of results. The C component determination results showed that when the difference of C component between the raw material and the standard was obvious, the response lines of two dose were not parallel, and then the reliability test results were affected. The reliability test could confirm to its requirement by replacing the raw material with another batch which C component was more similar to the standard. These improvements ensured the accuracy of the assignment of the national standard, and provided reference for the peers when they meet the same problems during the potency determination.

gentamicin; C components; double circles; method of three doses; reliability test

韩宁宁，从事抗生素检验检测工作。

赵晖。E-mail: 171977364@qq.com

2015-06-29

A

1002-1280 (2015) 09-0037-04

S859.796