氟苯尼考注射液中非法添加多西环素检查方法的建立

杨修镇，李赞阳，徐恩民，李淑花，王燕，张传法

(1.山东省兽药质量检验所；山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022；2.青岛康地恩动物药业有限公司，山东青岛 266111)



氟苯尼考注射液中非法添加多西环素检查方法的建立

杨修镇1，李赞阳2，徐恩民1，李淑花1，王燕1，张传法1

(1.山东省兽药质量检验所；山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022；2.青岛康地恩动物药业有限公司，山东青岛 266111)

为建立氟苯尼考注射液中非法添加多西环素高效液相检查方法，研究使用C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，以醋酸盐缓冲液[0.25 mol/L醋酸铵溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸二钠-三乙胺(100∶10∶1)，调节pH值至8.8]-乙腈(85∶15)为流动相，采用二极管阵列检测器，波长采集范围为200～400 nm，记录色谱图波长为269 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。结果表明，多西环素进样浓度在0.015～0.96 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1.0000)；平均回收率为99.4%(n=9)，RSD为0.3%。本方法简便、准确、可行，适用于氟苯尼考注射液中非法添加多西环素的检测。

高效液相色谱法；氟苯尼考注射液；多西环素

氟苯尼考收载于《中华人民共和国兽药典》二○一○年版一部，是动物专用的氯霉素类新型广谱抗生素。该药以甲砜基取代氯霉素分子结构中的硝基，消除了不可逆性致再生障碍性贫血的毒副作用；以氟基取代甲砜霉素分子结构中α-甲基位上的羟基，不仅抗菌活性增强，而且对大部分耐氯霉素和甲砜霉素的菌株仍有活性[1-2]。有研究表明氟苯尼考与多西环素联合在体外对鸡大肠杆菌虽呈无相关作用，但当两药联合治疗由该菌引起的疾病时可适当减小氟苯尼考的用量[3]。目前仅有饲料中非法添加多西环素的检测方法[4]，但是饲料与兽药的基质是完全不同的，因此，本研究对氟苯尼考注射液中非法添加多西环素的检查方法进行了研究。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)。多西环素对照品，批号130485-201202，中国食品药品检定研究院。氟苯尼考注射液(批号150201，山东鲁港福友药业有限公司提供；批号20150101，标识生产单位为江西某生物科技有限公司)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱条件 根据参考文献[5]方法，色谱柱为C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为醋酸盐缓冲液[0.25 mol/L醋酸铵溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸二钠-三乙胺(100：10：1)，调节pH值至8.8]-乙腈(85：15)，二极管阵列检测器，波长采集范围为200 ～400 nm，记录269 nm波长处的色谱图，流速1 mL/min，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取多西环素对照品56 mg(含量85.7%)置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.96 mg/mL的多西环素对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释成0.12 mg/mL的多西环素对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取氟苯尼考注射液适量，精密称定，置250 mL容量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL约含氟苯尼考0.6 mg的溶液(另取本品，同时测定其相对密度，将称样量换算成毫升数，计算)，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 取不含多西环素的氟苯尼考注射液(批号150201，山东鲁港福友药业有限公司提供)按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.4 阳性样品溶液制备 取不含多西环素的氟苯尼考注射液(批号150201，山东鲁港福友药业有限公司提供)，每1 mL添加多西环素30 mg后按供试品溶液制备方法制备阳性样品溶液。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品溶液、阳性样品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，阳性样品溶液色谱中在与对照品色谱相应的位置出相同的峰，阴性样品无干扰，结果见图1-图3，多西环素对照品PDA光谱图见图4。

图1 多西环素对照品溶液HPLC色谱图

图2 阳性样品溶液HPLC色谱图

图3 阴性样品溶液HPLC色谱图

图4 多西环素对照品PDA光谱图

2.4 检出限 按上述色谱条件，将对照品溶液进一步稀释，同时记录色谱图及光谱图，报告溶液光谱图失真的最大浓度为检出限，多西环素光谱失真的最大进样浓度为6 μg/mL。检出限根据氟苯尼考注射液规格不同分别为3.0 mg/mL(规格2 mL∶1.5 g、100 mL∶3 g)、2.0 mg/mL(规格5 mL∶1 g、10 mL∶2 g)、1.5 mg/mL(规格5 mL∶0.75 g、10 mL∶1.5 g)、1.0 mg/mL(规格5 mL∶0.5 g、100 mL∶10 g)、0.5 mg/mL(规格5 mL∶0.25 g、10 mL∶0.5 g、50 mL∶2.5 g、100 mL∶5 g)。

2.5 线性关系考察 精密量取多西环素对照品贮备液，用0.01 mol/L盐酸溶液逐级稀释成0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96 mg/mL的系列溶液，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，以峰面积(y)为纵坐标，浓度为横坐标(x，mg/mL)，进行线性回归分析。回归方程为：y=2.1877×107x-64426(r=1.0000)，结果表明多西环素进样浓度在0.015～0.96 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

2.6.1 仪器精密度试验 精密吸取0.12 mg/mL的多西环素对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，连续测定6次，峰面积RSD为0.1%，表明有仪器有良好的精密度。

2.6.2 重复性试验 取同批氟苯尼考注射液(批号20150101，标识生产单位为江西某生物科技有限公司)，按供试品溶液制备项制备样品溶液，制备6份，分别注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，多西环素平均含量为38.6mg/mL，RSD为0.5%，表明重复性好。

2.7 回收率试验 取不含多西环素的氟苯尼考注射液(批号150201，山东鲁港福友药业有限公司提供)，每1mL分别添加多西环素15、30、60mg，各平行3份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，多西环素平均回收率为99.4%，RSD为0.3%，结果见表1。

表1 回收率试验

2.8 耐用性试验

2.8.1 供试品溶液的稳定性 取同一供试品溶液，于制备后0、2、4、6、12、24 h注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定，多西环素峰面积的RSD为0.2%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.8.2 色谱条件的微小变动 取同一供试品溶液和对照品溶液，将流动相调整为醋酸盐缓冲液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠-三乙胺(100∶10∶1)，调节pH值至8.8]-乙腈(84∶16)、(86∶14)；醋酸盐缓冲液用冰醋酸或氨水调节pH值至8.7、8.9；柱温的调整为20℃、30℃；流速调整为0.95、1.05mL/min；记录色谱图波长调整为267、271nm，并更换不同厂家的同类型色谱柱分别进行测定，多西环素与氟苯尼考分离效果无明显差异，多西环素含量的RSD为1.1%，表明色谱条件的微小变动对测量结果无明显影响。由于柱温在20℃和30℃多西环素与氟苯尼考分离效果无明显差异，室温能满足检测要求，故未对柱温做具体规定。

2.9 判定依据 在相同实验条件下，供试品色谱图中如出现色谱峰与相应对照品主峰保留时间一致(差异小于等于±5%)；在200～400nm波长范围内，供试品出现的色谱峰与相应对照品色谱峰相对峰高大于10%时，两者光谱图无明显差异(必要时可调整供试品溶液的浓度)；最大吸收处波长一致(差异小于等于±2nm)，则判为检出被测试药物[6]。供试品色谱图中如出现与相应对照品保留时间一致的色谱峰，但小于检出限，判定为未检出被测试药物。

检出限根据氟苯尼考注射液规格不同分别为3.0mg/mL(规格2mL∶1.5g、100mL∶3g)、2.0mg/mL(规格5mL∶1g、10mL∶2g)、1.5mg/mL(规格5mL∶0.75g、10mL∶1.5g)、1.0mg/mL(规格5mL∶0.5g、100mL∶10g)、0.5mg/mL(规格5mL∶0.25g、10mL∶0.5g、50mL∶2.5g、100mL∶5g)。

3 讨论与小结

在本研究规定的色谱条件下，多西环素在269和364 nm有最大吸取，前者的吸收强度明显高于后者，故选择定量波长为269 nm。

由于需要对被测试药物优先进行定性判断，故本研究检出限以光谱图失真为依据，与传统含量测定以信噪比1∶3做为检出限有所不同，在光谱图失真时信噪比仍大于1∶10，故未对定量限再做规定。

在依据农业部1934号公告对氟苯尼考制剂中非法添加磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶进行检测时发现批号20150101，标识生产单位为江西某生物科技有限公司的氟苯尼考注射液色谱图在磺胺间甲氧嘧啶相近位置出现一色谱峰，但是该色谱峰紫外吸收光谱与磺胺间甲氧嘧啶不一致。该色谱峰紫外吸收光谱与多西环素较为类似且该氟苯尼考注射液为黄色，因此，使用多西环素对照品对比的方式，先确定非法添加物为多西环素，再根据文献资料对色谱系统进行优化，来实现磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素的有效分离。

与饶钦雄等[4]建立的饲料中多西环素的毛细管电泳检测方法相比较，由于氟苯尼考注射液与饲料的基质不同，本方法的前处理方法更为简单；高效液相色谱法与毛细管电泳法相比虽然试剂消耗量大但是准确度更高、重复性更好，本方法检测多西环素的平均回收率为99.4%(RSD为0.3%)，远高于毛细管电泳法的约90%(RSD约为5%)。

常用兽药大多具有紫外吸收，当它们被用作非法添加时往往能够通过色谱图和紫外光谱图对比的方式检测出来。如果能够建立常见药物的紫外光谱图库，正常检测时打开PDA的3D通道，发现不应有的杂峰时，提取杂峰的紫外光谱图与图库进行匹配，找出疑似添加物，然后选择合适的标准或建立合适的色谱系统进行色谱图和紫外光谱图对比，这样非法添加的检测效率就能够大大提高。

本试验建立的氟苯尼考注射液中非法添加多西环素检查方法，简便、准确度高、重复性好，适用于氟苯尼考注射液中非法添加多西环素的检测。

[1]UedaYS，htsukiS，NarukawaN，etal．Efficacy of florfenicol on experimental actinobacillus pleuropneumonia in pigs[J]．J Vet Med Sci，1995，57(2)：261-265﹒

[2] Hoar B R，Murray D J．A comparison of the clinical field efficacy and safety of florfenicol and tilmicosin for the treatment of undifferentiated bovine respiratory disease of cattle in western Canada[J]．Can Vet J，1998，39(3)：161-166﹒

[3] 苑 丽，胡攻政，刘智明，等﹒氟苯尼考与多西环素联合对鸡大肠杆菌病的治疗效果[J]﹒河南农业大学学报，2005，39(1): 93-97﹒

[4] 饶钦雄，任琳琳，童敬，等﹒饲料中3种四环素类药物的高效毛细管电泳检测方法[J]﹒中国畜牧兽医，2009，36(9): 74-78﹒

[5] 中华人民共和国兽药典委员会﹒中华人民共和国兽药典二○一○年版一部[S].

[6] 农业部﹒中华人民共和国农业部公告第1934号[S].

(编辑：陈希)

Establishment of Detection Methods for Doxycycline in Florfenicol Injection

YANG Xiu-zhen1,LI Zan-yang2,XU En-min1,LI Shu-hua1,WANG Yan1,ZHANG Chuan-fa1

(1.ShandongProvincialVeterinaryMedicineSupervisionInstitute;InstituteofVeterinaryDrugQualityInspectionofShandongProvince,Jinan250022,China;2.QingdaocontinentAnimalPharmaceuticalCo.,LTDL,Qingdao,Shandong266111,China)

A detection method of doxycycline illegally adulterated in florfenicol injection was established by HPLC. The isolation was performed on a C18 column(4.6 mm×150 mm，5 μm) with mobile phase consisting of acetate buffer[0.25 mol/L ammonium acetate solution - 0.1 mol/L disodium Edetate solution - triethylamine(100∶10∶1), adjust pH to 8.8] - acetonitrile (85∶15). Photodiode array detector wavelength range was 200～400 nm, The recorded wavelength was 269 nm, The flow rate was 1 mL/min, The injection volume was 10 μL.The results showed that there was a good linear correlation between the peak areas and the concentrations of doxycycline at the range of 0.015～0.96 mg/mL(r=1.0000). The average recovery was 99.4% withRSDof 0.3%(n=9).This method was simple, accurate and feasible . It was suitable for detection of doxycycline illegally adulterated in florfenicol injection.

HPLC; florfenicol injection ; doxycycline

杨修镇，兽医师，从事兽药和畜禽产品质量监督检验及科研工作。E-mail: yangxiuzhenaaa@126.com

2015-05-28

A

1002-1280 (2015) 09-0041-04

S859.79