UPLC-MS/MS法检测动物性食品中19种β-受体激动剂残留

叶妮，孙雷，尹晖，王亦琳，毕言锋，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所， 北京 100081)



UPLC-MS/MS法检测动物性食品中19种β-受体激动剂残留

叶妮，孙雷，尹晖，王亦琳，毕言锋，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所， 北京 100081)

建立了前处理过程较为简便、能同时检测猪、牛和羊的肌肉、肝脏、肾脏和鸡蛋中特布他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、克仑塞罗、羟甲基克伦特罗、克仑丙罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、溴布特罗、克仑潘特、班布特罗、马布特罗、马喷特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗19种β-受体激动剂的UPLC-MS/MS方法。样品经乙腈-异丙醇混合溶液(4∶1，V/V)提取后，用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，混合型阳离子交换固相萃取柱净化，然后用UPLC BEH C18色谱柱分离，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，基质匹配溶液内标法或外标法定量。结果表明：19种β-受体激动剂在1～50 ng/mL基质匹配标准溶液浓度范围内呈现良好线性关系，相关系数R2均大于0.990；在猪、牛和羊的肌肉、肝脏、肾脏和鸡蛋中的检测限均为0.1 ng/kg，定量限均为0.5 ng/kg。从0.5、1、2和5 ng/kg四个添加浓度检测结果可以看出，19种药物的回收率范围为60%～120%，批内、批间相对标准偏差均小于20%。该方法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。

动物性食品；β-受体激动剂；残留；超高效液相色谱-串联质谱

β-受体激动剂(β-agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物，为儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的化学类似物。一般可分为含取代基的苯胺型(如克仑特罗)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大类[1]。该类药物主要用于防治人和动物支气管哮喘和支气管痉挛。80年代，国内外研究表明，在饲料中添加此类药物具有营养再分配作用，可明显提高动物瘦肉率，因此曾被作为药物促生长添加剂被广泛关注[2]。而人食用了有这类药物残留的畜禽产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状，严重者可危及生命[3]。因此欧盟、美国等先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物[4]，我国政府也明令禁止其使用，我国农业部先后发布了176号公告、235号公告和1519号公告，先后共禁止使用16种β-受体激动剂类药物[5-7]。

目前，关于动物性食品中β-受体激动剂残留检测方法已有很多，主要有ELISA法、GC-MS法和LC-MS/MS法。其中ELISA法具有快速、高通量的优点，但检测药物种类有限，且无法进行多残留检测；GC-MS法可进行多残留检测，但样品前处理过程需衍生化，方法稳定性和定性准确性方面欠佳；LC-MS/MS法可进行多残留检测，但现有方法前处理过程较为繁琐，检测动物性食品的种类以及检测药物的种类相对较少。研究针对我国消费量较大的猪、牛和羊的肌肉、肝脏、肾脏和鸡蛋等10种组织，制定一种前处理过程快速简便、能同时检测19种β-受体激动剂的UPLC-MS/MS方法，以保障对动物性食品中该类药物多残留的确证检测。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acqutiy UPLC-Premier XETM质谱联用仪(Waters公司)；电子天平(Mettler Toledo 公司)；高速冷冻离心机(Heraeus公司)；氮吹仪(Jnc公司)；涡旋混合器、水平振荡器(IKA 公司)。

1.2 药品和试剂 特布他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、克仑塞罗、羟甲基克伦特罗、克仑丙罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、溴布特罗、克仑潘特、班布特罗、马布特罗、马喷特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗，纯度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷、甲酸为色谱纯(Fisher公司)；乙酸铵为分析纯；所用水为超纯水。

1.3 对照溶液配制 精密称定适量的特布他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、克仑塞罗、羟甲基克伦特罗、克仑丙罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、溴布特罗、克仑潘特、班布特罗、马布特罗、马喷特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗对照品，用甲醇分别配制成1 mg/mL的各药物标准储备液。准确吸取0.1 mL的各药物标准储备液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，即得10 μg/mL的混合标准工作液，从中准确吸取0.1 mL的混合标准工作液于同一10 mL容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1∶9，V/V)稀释并定容至刻度，即得100 ng/mL的混合标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取与酶解 准确称取2(±0.02)g试料于15mL塑料离心管内，加入适量内标，加入6 mL乙腈-异丙醇混合溶液(4∶1，V/V), 涡旋混匀后，中速水平振荡5 min，10000 r/min离心8 min，取上清液于55℃下氮气吹至近干。加入0.2 mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH=5.2)2 mL，充分溶解，再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL[4]，涡旋混匀，于55℃下避光水浴振荡2 h。取出后放置至室温，加甲醇4 mL，涡旋混匀，肌肉和肾脏组织8000 r/min离心5 min，上清液备用；肝脏组织8000 r/min离心5 min，转移上清液至另一15 mL塑料离心管内，加入3 mL正己烷，充分涡旋后，8000 r/min离心5 min，弃上层溶液，下层溶液备用；鸡蛋加入3 mL正己烷，充分涡旋后，8000 r/min离心5 min，弃上层溶液，下层溶液备用。

1.4.2 样品净化 混合型阳离子交换固相萃取柱(500 mg/6cc)依次用甲醇、2%甲酸溶液各5 mL活化，取各组织备用液全部过柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱。洗脱液于50℃下氮气吹干，残余物中加甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，V/V)0.5 mL，充分溶解，取上清液适量，过0.2 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2 min，5%A线性变化至10%A；2～12 min，10%A线性变化至60%A；12～14.5 min，维持100%A，14.5～16.5 min，维持10%A；流速为0.3 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.2 kV；萃取电压为3.0 V；预六极杆电压为0.5 V；源温为110℃；脱溶剂温度为350℃；脱溶剂气速为650 L/Hr；锥孔反吹气速为50 L/Hr。

1.5.3 定性与定量 该方法定性需满足四个条件：① 空白实验不出现与阳性对照相同的离子峰；② 特征离子色谱峰信噪比(S/N)都在3∶1以上； ③ 试样色谱峰保留时间应与校正溶液的一致，容许偏差为±2.5%；④ 检测到的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差达到欧盟2002/657/EC中的规定。定量时以响应强度最强的离子对作为定量离子，通过基质匹配标准溶液内标法或外标法进行定量。

2 结果与分析

2.1 样品的提取与酶解 现有β-受体激动剂的前处理几乎均是用pH=5.2的乙酸铵缓冲液进行提取，然后用浓氢氧化钠溶液调节pH至碱性，进而再采用有机溶剂进行液液萃取。其中用乙酸铵缓冲液进行提取对部分β-受体激动剂的提取效率不高，用极性大的乙腈进行提取的提取效率较高，同时加入少量的异丙醇有利于极性偏低药物的有效提取(美国FSIS检测SOP)，本方法采用乙腈-异丙醇(4∶1，V/V)直接对样品进行提取，可以同时有效提取其中的游离态和结合态的β-受体激动剂，同时通过高速离心又能很好的去除蛋白质等大量的干扰杂质，为后续的酶解和净化奠定基础。

因大多数β-受体激动剂类药物在动物体内代谢过程中很容易发生Ⅱ相轭合反应，主要是与葡萄糖醛苷或芳基硫酸相结合，且结合态的药物极性比原型更强，因此在用极性的乙腈-异丙醇混合溶液提取时游离态的原型药物和结合态的药物都能提取出来，提取后再进行有效的酶解，可以减少大量杂质的干扰。

2.2 样品的净化 β-受体激动剂属于偏碱性的化合物，商品化的混合型阳离子交换固相萃取柱以阳离子交换和反相固相萃取为基础，非常适合碱性化合物的阳离子交换和反相吸附，因此本方法采用该类型的固相萃取小柱进行净化。由于样品中可能含有脂肪等成分，尤其是鸡蛋样品和肝脏样品，可能含有较多的脂溶性杂质，因此对于肝脏、鸡蛋等样品在萃取柱净化之前采用正己烷进行除脂，起到了很好的净化效果。

2.3 分析方法评价2.3.1 监测离子 按照欧盟对违禁使用兽药残留确证检测的要求，要确证β-受体激动剂至少需要4个识别点(IP)，因此利用串联质谱仪选择每种药物的母离子以及对应的两个响应较强的子离子，通过多反应监测离子(MRM)方式进行采集，这样一个母离子1个IP点，对应两子粒子分别1.5个IP点，刚好满足4个IP点的要求。根据9种β-受体激动剂一级质谱扫描和二级质谱扫描，确定了各自的监测离子(表1)。

表1 19种β-受体激动剂及同位素内标的定性、定量离子对及对应锥孔电压、碰撞能量参考值

续表

2.3.2 方法线性 分别精密量取适量的克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等19种标准工作液，制得浓度为1、2、5、10、20、50 ng/mL(有内标物的其内标浓度均为10 ng/mL)各系列对照溶液0.5 mL，加入到经提取、酶解、净化后的样品基质中，值得对应的基质匹配系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱法测定。内标法以各特征离子质量色谱峰与相应同位素内标的峰面积比为纵坐标，对照溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。外标法以各特征离子质量色谱峰为纵坐标，对照溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。以杂质较复杂切前处理步骤较为繁琐的猪肝脏组织为例，由19种β-受体激动剂类药物的回归方程及相关系数R2(表2)可以看出：19种β-受体激动剂类药物在1～50 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，R2均大于0.990。

表2 猪肝脏组织中19种β-受体激动剂标准曲线及相关系数

续表

2.3.3 方法灵敏度和精确度 采用空白组织中添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N>3为方法检测限，S/N>10为方法定量限，得出特布他林、齐帕特罗、沙丁胺醇等19种β-受体激动剂在样品中的检测限均为0.1 ng/g，定量限均为0.5 ng/g。

1 ng/g空白猪肝添加试液中19种β-受体激动剂及同位素内标的特征离子质量色谱图见图1。

图1 1μg/kg空白猪肝添加试液中19种β-受体激动剂及同位素内标特征离子质量色谱图

采用标准添加方法，在空白猪、牛、羊肌肉、肝脏、肾脏和鸡蛋中添加4个不同浓度(定量限、低、中、高四个浓度)的19种β-受体激动剂进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差，表3给出了基质复杂的猪肝组织中19种β-受体激动剂添加回收率实验结果。从表中可以看出本方法在空白猪肝中进行0.5～5 ng/g的添加浓度，方法的回收率均为60%～120%，批内、批间相对标准偏差均小于20%。

表3 猪肝组织中19种β-受体激动剂添加回收率实验结果(n=5)

续表

3 结论

本方法通过对样品前处理条件的充分优化改进，建立了适用于猪、牛和羊的肌肉、肝脏、肾脏和鸡蛋等10种动物性食品中特布他林、齐帕特罗、沙丁胺醇等19种β-受体激动剂残留检测的UPLC-MS/MS方法。该方法前处理过程简便、灵敏度和精确度均能满足兽药残留分析方面的要求。

[1] 朱坚,李波,方晓明. 气相色谱质谱法测定肝、肾和肉中11种β-受体激动剂残留量[J]. 质谱学报, 2005,03 :3-11.

[2] 孟娟，邵兵，吴国华. 气相色谱-质谱法同时测定动物性食品中8种β-兴奋剂的残留量[J]:5-7.

[3] 刘敏，刘戎，王立琦.猪肝中β-受体激动剂多残留的样品前处理方法比较及同时检测[J]. 分析测试学报, 2012, 03:56-61.

[4] 刘佳，梁桂荣，谢云峰.液相色谱-串联质谱法检测猪尿中26种β_2-受体激动剂类药物残留[J]. 食品安全质量检测学报, 2014,09:149-156.

[5] 农业部. 农业部公告第176号禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录[S].

[6] 农业部. 农业部公告第235号动物性食品中兽药最高残留限量[S] .

[7] 农业部. 农业部公告第1519号禁止在饲料和动物饮水中使用的物质[S] .

(编辑：陈希)

农业部公布81个兽用生物制品标准废止目录

(中华人民共和国农业部公告第2294号)

为加强兽用生物制品标准管理工作，确保产品安全、有效、质量可控，我部组织开展了兽用生物制品标准清理工作。经研究，对不符合当前国家动物防疫政策、存在较大生物安全隐患、已被新产品取代且至少5年无企业生产，以及检验项目不全、不能保证产品质量的81个兽用生物制品标准予以废止(见附件)，自本公告发布之日起执行。现就有关事项公告如下。

一、自本公告发布之日起，停止受理、审批上述81个兽用生物制品的产品批准文号申请。

二、自2016年1月1日起，停止生产上述81个兽用生物制品，涉及相关企业的兽药产品批准文号同时撤销。2015年12月31日前生产的产品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2017年1月1日起，停止经营、使用上述81个兽用生物制品。

附件：废止兽用生物制品标准目录(省略)

农业部

2015年9月1日

摘自中国兽药信息网

Determination of β-agonists in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

YE Ni1, SUN Lei1, YIN Hui1,WANG Yi-lin1,BI Yan-feng1, WANG He-jia1,XU Shi-xin1

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China；2JiangsuProvincialTestCentreofAnimalBy-ProductQuality，Nanjing210036，China)

A UPLC-MS/MS method was established for the determination of terbutaline, zilpaterol, salbutamol, cimaterol, cimbuterol, clenciterol, hydroxymethyl clenbuterol clenproperol clorprenaline, ractopamine, clenbuterol, tulobuterol, brombuterol, clenisopenterol, bambuterol, mabuterol, mapenterol, phenyl ethyl alcohol amine A and penbutolol residue in animal derived food. After the tissues were extracted by Acetonitrile-2-Methyl-1-propanol, enzymolysis,centrifuged, neutralized, followed by liquid-liquid extraction with ethyl acetate andtert-butyl methyl ether, respectively. The combined extracts were applied to a solid phase extraction MCX cartridge for cleanup. The separation of β-agonists was performed on Waters Acquity UPLC system with the column of BEH C18 and the gradient elutinon solvent of acetonitrile(0.1% formic acid) and water(0.1% formic acid) at a flow rate of0.3mL/min. The method was quantified by blank tissue spiked standard curves. The calibration curves were good linear between the peak areas and the concentrations of 1～50μg/kg，the correlation coefficient R2>0.990. The limits of detection of the 19 β-agonists in animal derived food were 0.1μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg. The average recoveries from spiked animal tissues at three concentrations of 0.5,1,2 and 5 μg/kg ranged 60%～120%. The intra- and inter-batch variation coefficients were both less than 20%.

animal derived food；β-agonists；residue；UPLC-MS/MS

叶妮,从事兽药残留相关方面工作。E-mail: yeni527@126.com

2015-08-13

A

1002-1280 (2015) 09-0051-09

S859.84