IBDV B87株不同鸡胚代次毒力和细胞嗜性差异的比较研究

陈玲，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)



IBDV B87株不同鸡胚代次毒力和细胞嗜性差异的比较研究

陈玲，蒋桃珍*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

对IBDV疫苗株 B87的鸡胚传代毒E2和E6的VP2片段进行测序和分析，发现两个代次毒株VP2序列存在7个氨基酸的差异，即S76G、 L217S、 Q253H、 D279N、 A284T、 I294L、 S330R。将E2和E6接种CEF细胞，E2不能在CEF上增殖，而接种E6的CEF细胞可以产生明显的CPE，说明两个毒株对CEF的嗜性不同。分别将E2和E6接种3周龄SPF鸡，对鸡的毒力进行比较，接种后第7 天开始，E2出现囊体比下降，BB指数明显低于E6，相应的法氏囊切片经HE染色后，接种E2的法氏囊滤泡萎缩严重，结构松散，E6只有部分滤泡出现萎缩，滤泡间隔基本正常，说明E2，E6对SPF鸡法氏囊毒力存在明显差异。根据两个毒株的VP2序列差异以及相关研究，推测Q253H/D279N/A284T三个位点突变可能是IBDV毒力和细胞嗜性差异的分子基础，但另外4个位点也可能对IBDV毒力差异产生影响。

传染性法氏囊病毒；VP2基因；毒力差异；细胞嗜性

传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的雏鸡的一种急性、高度接触性传染病，给世界养禽业造成了严重的经济损失[1]。VP2是IBDV的主要宿主保护性抗原，病毒的抗原变异、细胞嗜性和毒力强弱都与VP2的高变区密切相关，但是具体的毒力位点尚存在争议[2-3]。

1987年以来，超强毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)的出现和流行使得IBDV成为危害世界养禽业的重要病源之一[4]，随着反向遗传学的发展，尤其是1996年vvIBDV反向遗传操作系统的建立[5]，越来越多的研究集中在vvIBDV的细胞嗜性和毒力位点上，取得了较大的进展，但具体的毒力位点仍没有确定。本研究从中等毒力疫苗株B87入手，通过分析不同鸡胚传代毒株E2和E6的VP2序列变化，比较两个毒株细胞嗜性和对SPF鸡毒力差异，探究IBDV的细胞嗜性和毒力位点，对于明确IBDV毒力变异的分子基础，探索IBDV致弱的方法和疫苗研发具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 种毒 IBDV B87 E2 (AV140 1987.05), E6(AV140 2010.12)为本所保藏。

1.2 SPF鸡和鸡胚 三周龄SPF鸡和SPF鸡胚均购自北京梅里亚维通公司。

1.3 菌株、载体和主要试剂 大肠杆菌JM109感受态细胞、RNA提取试剂盒、DNA Marker为Takara产品；Reverse Transcription System为Invitrogen公司产品；pfu高保真聚合酶为Promega公司产品；Zero-TOPO载体购于Clonesmarter公司; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Omega产品; DMEM/F12(1∶1), Foetal Bovine Serum为 GIBCO产品。

1.4 PCR 引物设计和合成根据GeneBank 中IBDV B87株VP2序列，利用引物设计软件Primer 5.0，在A片段的上半段设计一对引物(表1)，由上海立菲生物科技有限公司合成。

表1 VP2扩增引物

1.5 IBDV基因组RNA的提取 参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书进行。

1.6 RT-PCR 根据反转录试剂盒说明，用随机引物作为反转录引物，对提取的RNA进行反转录。以反转录产物为模板，以A5/A3为引物进行PCR扩增。反应体系：10×Buffer 5 uL，dNTP 4 uL，A5、A3(10 umol/L)各2 uL，模板5 uL，pfu 0.5 uL，ddH2O 31.5 uL；反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃10 min。取5 uL PCR产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。

1.7 PCR产物的克隆和鉴定 将PCR产物回收后，与pCloneEZ-TOPO载体连接，转化到JM109细胞，取100 uL涂布含有氨苄的LB琼脂，37 ℃过夜培养。利用菌落PCR的方法鉴定重组子，挑选阳性克隆送往上海立菲生物技术有限公司测序。

1.8 E2、E6在CEF上的增殖 按照《中国兽药典》中鸡胚成纤维细胞的制备方法，制作CEF细胞，分装到T25细胞瓶中，细胞密度为106/mL。将E2和E6毒株稀释100倍，分别取1 mL同步接种9 mL CEF细胞，37 ℃ 5% CO2培养72 h。

1.9 E2、E6对SPF鸡的毒力比较 75只三周龄SPF鸡随机分成三组，每组25只，第一组和第二组作为试验组，其余为对照组；分别将E2和E6进行10×稀释，点眼接种25只SPF鸡，0.2 mL/只；在接种后3 d、7 d、14 d和21 d，每组取5只SPF鸡致死后，称取鸡重，碘酊涂抹后采囊，观察有无明显病变，称取法氏囊重量，并收集不同时间的法氏囊，保存在10%中性福尔马林液中，用于制作病理切片。

2 结果与分析

2.1 E2、E6 VP2序列 比较从E2和E6 VP2氨基酸水平系统进化树(图1)可以看出，E2和E6位于不同的分支上，E6与弱毒株处于同一进化群，而E2则与经典毒株亲缘关系更近一些。

E2和E6VP2氨基酸序列差异如表2所示。E2和E6在VP2上有7个氨基酸差异，其中253、279和284是目前研究最多的三个位点，与IBDV的毒力和细胞嗜性密切相关；294I是vvIBDV的特征性氨基酸之一；330位于富含丝氨酸的七肽区(S-W-S-A-S-G-S)，该区域通过氢键影响分子内部或分子间的相互作用从而影响毒力；另外两个位点76和217，目前没有相关文献报道。

D78、Gt、PBG-98、P2、Cu1、JD1为弱毒株; STC、A-BH83、52/70、Cu-1wt为经典毒株; GLS、variant E为变异株;IBDVks、UK661、D6948、OKYM、HK46为超强毒株;2512为中等毒力疫苗株

表2 E2和E6VP2上存在差异的氨基酸位点

2.2 E2和E6对CEF细胞嗜性比较 E6在接种CEF后24 h，开始出现细胞病变，细胞团聚，碎裂，折光性增强，呈砂砾状，48 h细胞病变加剧；E2在接种后72 h，一直没有出现CPE。结果说明E2和E6对CEF细胞嗜性存在差异，E6可以在CEF上增殖，但是E2不能适应CEF培养。

2.3 E2和E6对SPF鸡的毒力比较 实验过程中，所有的SPF鸡均没有出现死亡或者IBD的典型临床症状，接种后3 d，法氏囊均没有出现胶冻样水肿、出血等法氏囊强毒感染后的特征性病理变化，接种两个代次毒的法氏囊大小也与正常对照相似。但接种后7d开始，E2代接种鸡法氏囊明显萎缩，其两个代次毒接种后不同时间的囊体比和BB指数分别见图2和图3。

图2 接种E2、E6的SPF鸡囊体比

BB指数低于0.7表示法氏囊萎缩

图2结果显示，E2与E6株在接种后3 d，囊体比与对照没有差异，E6株在接种后14 d出现短暂性的法氏囊萎缩，21 d时恢复正常；E2株从接种后7 d开始，囊体比明显下降。

从图3可以看出，与囊体比指标一致，E2与E6株在接种后3 d时，BB指数相同。E6株在接种后第14天BB指数为0.69，略低于0.7，其余时间点均高于0.7。E2株从第7天开始，BB指数明显下降，维持在0.3左右。

2.4 法氏囊的病理组织学变化 结果见图4。接种E6的SPF鸡在第3天法氏囊部分滤泡出现轻微萎缩，接种后7 d, 滤泡淋巴细胞开始流失，滤泡间隔增宽，第14天开始恢复，21 d基本正常。E2在接种后3 d少量滤泡开始萎缩，髓质中淋巴细胞出现流失，7 d和14 d滤泡间结缔组织增生，间隔变宽，滤泡变小，大量淋巴细胞流失，21 d萎缩开始恢复。

图4 E2、E6和对照组在接种SPF鸡后3 d、7 d、14 d和21 d法氏囊HE染色图(10×)

3 讨论

晶体学结构表明每一个VP2蛋白亚单位分为base(B)、shell(S)和projection(P)三个结构域，B和S分别由相对保守的VP2的N端和C端构成，而P则是由VP2的可变区(aa206～350)构成。通过对大量的野毒株VP2序列进行比对，Van den Berg等[6]认为IBDV的VP2的可变区可以看做是vvIBDV在演化系谱中的一种分子标志，VP2可变区的氨基酸变异可能会造成IBDV毒力和细胞嗜性的变化。

IBDV在鸡体传代后毒力会增强，而在鸡胚和细胞上传代后毒力会减弱[7]。本研究选择中等毒力疫苗株在鸡胚上传代后的E2和E6毒株，测序发现其VP2上氨基酸存在较大差异。通过接种三周龄SPF鸡，发现两个毒株对法氏囊造成的萎缩程度明显不同，E6代毒株对于SPF鸡的毒力比E2代毒株弱。

VP2片段测序分析发现，E2与E6在VP2上存在7个位点的差异，即S76G、L217S、Q253H、D279N、A284T、I294L、S330R。Yamaguchi[2]、Brandt[8]、Van loon[9]等的研究表明，Q253H、D279N和A284T三个位点与病毒毒力密切相关。根据VP2片段的多序列比对结果，发现位于VP2 P结构域顶端的PDE(aa240～265)和PFG(aa270～293)两个区域可能与IBDV毒力相关[10]，而253、279和284三个位点正好位于PDE和PFG上，253位点由线性的氨基酸Q变成环形的H以及284位由非极性氨基酸A变成极性的T都有利于β转角的形成，从而改变VP2的构象[11]。Yamaguchi将253H的疫苗株在鸡体内连续传代后会发生H253Q的变异，并且变异后毒力明显增强；Jackwood等[12]研究发现，H253Q/N的突变可以显著增强弱毒株的毒力，与Yamaguchi等[2]的研究结果一致；宫世玲等[13]将两株弱毒株在机体内连续传代6次，也发现了同样的规律。本研究中的B87 E2和E6代毒株也存在Q253H、D279N和A284T的变异，但由于还有其他4个位点的差异，所以不能确定接种E2株SPF鸡法氏囊的变化是否只是由这3个位点引起。

294I是IBDV超强毒株的特征性氨基酸位点[14]，该位点的突变可能与毒力差异相关；VP2的可变区有两个亲水峰，A(aa 210～215)和B(312～324)，这两个亲水峰编码序列的突变与抗原变异和血清I型毒株的毒力相关[17]，因此L217S的突变也可能也会造成毒力下降，但需要进一步的研究证实；另外一个位点S76G位于VP2的N端的保守区，对毒力影响不大；Heine[7]在比对了强毒株和能适应CEF的低致病性毒株的VP2序列后，认为富含丝氨酸的七肽区S-W-S-A-S-G-S(aa 326～332)是高致病性毒株的保守序列，该区域可能通过氢键改变分子间或分子内的相互作用从而影响毒力，但Yamaguchi等[2]在比对超强毒株OKYM及其细胞适应毒株OKYMT后，发现这两个毒株都有S-W-S-A-S-G-S七肽序列，因此，330位S到R的突变或许并不影响毒力。

将两个毒株同时接种CEF，E6可以在CEF上产生CPE，E2则不能在CEF上增殖，说明E2和E6株对CEF的嗜性不同。研究表明，VP2的氨基酸位点253、279和284与细胞嗜性有关，Q253H和A284T同时突变，可以使毒株在CEF上有效复制，但是单一位点的突变不能适应CEF培养[15]；双突变D279N和A284T可以使HK46(vvIBDV)适应细胞生长并获得较高滴度，但UK661经过双突变后，病毒滴度低了很多[16]，Abdeljel等[17]通过定点突变D279N/A284T发现vvIBDV PO7突变株也可以适应CEF生长。说明284T是IBDV适应细胞的关键位点，但也需要Q253H或者D279N发生突变。研究表明Q253H、 D279N和A284T是IBDV细胞嗜性的分子基础，但具体的分子机制还需要进一步的研究。

为进一步确定E2和E6代毒株的毒力和细胞嗜性位点，可以利用反向遗传学技术对E2毒株的VP2进行定点突变来进行验证，通过疫苗毒株来研究IBDV毒力与细胞嗜性的分子机制。

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(编辑：李文平)

Study on Virulence and Cell Tropism Difference of IBDV B87 Passage Strains in Chicken Embryo

CHEN Ling，JIANG Tao-zhen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

E2 and E6 were passage strains of moderate virulent vaccine strain B87 in chicken embryo, VP2 was sequenced and analyzed, and there are 7 amino acid mutations in VP2 between E2 and E6, S76G, L217S, Q253H, D279N, A284T, I294L, S330R. CEF were infected with E2 and E6, E2 could not adapt to CEF, but E6 could induce CPE. 3-weeks SPF chickens were inoculated to compare the safety difference of the two strains, then bursas of Fabricius from each group were removed and evaluated for histo-pathologic lesions at 3 d, 7 d, 14 d and 21 d, separately, and the bursa to body weight ratio and bursa: body-weight index(BB Index) were also determined. Chicken experiments reveal that the bursa to body weight ratio of SPF chickens infected with E2 began to decrease from 7 days post inoculation, and the BB Index of E2 was also much lower than that of E6. Bursas of chicks inoculated with E2 show atrophy and loss of the follicular architecture at 7 days post infection, while bursas of that inoculated with E6 had a small part of follicles atrophy, with normal follicular connective tissues. This study suggests that mutations of Q253H/D279N/A284T may be the molecular basis of virulence and cell tropism, but the other 4 mutations may also influence the virulence of IBDV.

IBDV; VP2 gene; virulent difference; cell tropism

陈玲，硕士研究生，从事预防兽医学研究。

蒋桃珍。E-mail：taozhen_jiang@163.com

2015-05-04

A

1002-1280 (2015) 10-0005-05

S858.31