树突状细胞甘露糖受体在旋毛虫感染中的变化研究

刘博宇，王丞，邢鑫，陈宏亮，姜晶，蔡亚南，赵权，王春凤，杨桂连

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，长春130118)



树突状细胞甘露糖受体在旋毛虫感染中的变化研究

刘博宇，王丞，邢鑫，陈宏亮，姜晶，蔡亚南，赵权，王春凤，杨桂连*

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，长春130118)

应用流式细胞术(FCM)检测旋毛虫感染后小鼠肠系膜淋巴结(MLN)中树突状细胞(DC)上甘露糖受体(MR)的影响。培养小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)并负载旋毛虫排泄/分泌抗原(ES抗原)，FCM检测BMDC上MR的变化情况。结果显示，感染第7天MLN中DC表面MR出现下调，但在14 d后出现上调，差异显著(P<0.05)。体外实验发现，BMDC负载ES抗原后MR出现下调，直到第48小时出现上调，差异显著(P<0.05)。本研究证明旋毛虫感染后可以引起树突状细胞上MR的变化，表明MR可能是ES抗原的识别受体。这为研制旋毛虫树突状细胞疫苗提供了支持，并对寄生虫免疫逃避机制的研究提供了思路。

甘露糖受体；旋毛虫；树突状细胞

旋毛虫病历史悠久，多年来一直无法彻底消除。作为一种有着重要研究价值的人兽共患寄生虫病，旋毛虫在机体的免疫逃避一直是众多研究者关注的焦点。ES抗原是旋毛虫在宿主体内寄生时分泌的复合抗原，已被证实在宿主对旋毛虫的免疫反应中起着重要的作用[1-2]。ES抗原多以糖蛋白的形式存在，含有大量的甘露糖、岩藻糖等糖类结构,这使其可能可以被C型凝集素受体识别[3]。DC既是最强的专职抗原递呈细胞，又是连接固有免疫与适应性免疫的重要桥梁。MR是DC上的C型凝集素受体，可以识别甘露糖结构，研究发现MR配体可刺激或抑制多种细胞因子的分泌[4-5]。抗原的识别与递呈是适应性免疫启动的关键环节，DC对抗原的摄取更是其引发免疫反应的第一步。MR作为模式识别受体，在抗原的摄取上有着关键的作用。本研究利用流式细胞术，检测旋毛虫感染小鼠后不同时间点肠系膜淋巴结中树突状细胞上MR的变化情况，并检测体外培养的小鼠骨髓源树突状细胞与旋毛虫ES抗原刺激后不同时间点的受体表达的变化情况，以初步探讨是否树突状细胞上的MR受体在旋毛虫感染过程中的起到作用，以便为旋毛虫免疫逃避机制的研究及树突状细胞疫苗的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫种和实验动物 旋毛虫由本实验室保种。4～6周龄SPF级雌性BABL/C小鼠60只、4～6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠10只,均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要试剂 小鼠FC BLOCK封闭抗体购自美国eBioscience公司；PE标记的抗小鼠MR单克隆抗体购自美国Biolegend公司；FITC标记的抗小鼠CD11c单克隆抗体购自美国BD公司；小鼠白介素-4(IL-4)和小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),均购自美国Peprotech公司；FACS缓冲液购自美国BD公司。

1.1.3 主要仪器 BD FACSCanto II流式细胞仪购自美国BD公司；恒温摇床购自施都凯仪器设备(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 将实验室保种的小鼠处死，剪碎肌肉组织后用人工消化液(含1%胃蛋白酶和1%浓盐酸)在37 ℃摇床内消化4 h，60目筛网过滤去渣。用37 ℃预热的生理盐水数次清洗虫体后计数，获取旋毛虫肌幼虫。

1.2.2 旋毛虫肌幼虫ES抗原的制备 收集的幼虫经培养，过滤，透析，浓缩后用0.22 μm细菌过滤器过滤即得纯净的旋毛虫肌幼虫ES抗原。SDS-PAGE鉴定。

1.2.3 旋毛虫感染后小鼠肠系膜淋巴结中DC上MR受体变化研究 36只雌性balb/c小鼠随机分为2组，每组18只，实验组每只灌服旋毛虫肌幼虫200条。空白组不作处理。两组小鼠分别于灌胃后第7、14、21、28、35、42天时取脾脏和肠系膜淋巴结，每次每组取3只。取肠系膜淋巴结制备单细胞悬液，计数。调整细胞至1×106个每管，制备未加抗体的阴性管和两个单标管。样品管加入FC BLOCK抗体，孵育15 min以避免荧光抗体的非特异性结合。加入FITC-CD11c、PE-MR抗体4 ℃孵育1 h，FACS缓冲液清洗两次以洗去未结合的抗体，送检。

1.2.4 小鼠骨髓源树突状细胞的培养及纯度测定 改良Talmor等[6]的方法制备BMDC。即脱颈处死雄性C57BL/6小鼠后浸入75%酒精中消毒片刻，无菌冲出骨髓。调整细胞浓度至1×106/mL，10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养24 h后去除未贴壁细胞，加入DC完全培养基(10%胎牛血清+40 ng/mL白介素4+40 ng/mL GM-CSF+100 IU/mL青链霉素+3.9 mg/L β巯基乙醇)，隔天半量换液，至第7天轻轻吹打后收集所有悬浮细胞既为BMDC。BMDC计数后取部分细胞加入FC BLOCK，孵育15 min后加入FITC-CD11c抗体4 ℃孵育1 h，FACS缓冲液清洗两次以洗去未结合的抗体，送检纯度。

1.2.5 ES抗原体外刺激BMDC后MR的表达量变化 将培养的BMDC分至48孔板中，每孔2×105个细胞，加入200 μL DC完全培养基，实验共分6组，其中一组空白组，其他分为6、12、24、36、48 h组。分别按照上述五个时间点加入ES抗原，每孔100 μg/mL。加入抗体同1.2.2项，送检。

2 结果与分析

2.1 旋毛虫肌幼虫ES抗原的制备及小鼠骨髓源树突细胞的培养 将获取的ES抗原进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果得到约为43、45和49 kDa的条带(图1)，符合旋毛虫ES抗原的特征。应用流式细胞术对培养出的BMDC进行纯度检验。结果显示其纯度可以达到实验的需求(图2)。

图1 SDS-PAGE分析ES抗原

图2 流式细胞术检测BMDC

2.2 旋毛虫感染后小鼠肠系膜淋巴结中树突状细胞表面MR表达量 结果显示在肠系膜淋巴结中，第7天MR的表达下调，随后开始上调，但第28天表现出和对照组接近相同的情况。在第35天又观察到MR的上调，第42天与对照组相比基本持平(图3)。

图3 MLN中MR的影响(*表示差异显著P<0.05)

2.3 ES抗原体外刺激BMDC后MR表达量变化 流式结果显示，与对照组相比，MR在第6～36 h出现了下调，差异显著(P<0.05)，48h出现了升高，差异显著(P<0.05)(图4)。

图4 负载ES抗原的BMDC上MR的变化

3 讨论与小结

寄生虫的免疫逃避一直以来都是研究的热点，越来越多的C型凝集素受体被证实在寄生虫的感染及免疫逃避中起到了一定作用。抗原的识别与递呈在免疫逃避中极为关键，黄海斌等研究发现球虫感染可以在后期引发淋巴细胞的变化，推测可能由于缺乏抗原的持续刺激所导致，而淋巴细胞的活化需要抗原递呈等过程作为前提[7]。MR作为发现较早的C型凝集素受体，具有抗原识别的功能，在一些研究中已经发现了其作用[8]。如克氏锥虫利用巨噬细胞上的MR逃避固有免疫，使其可以长期寄生[9]。由于MR的胞质尾部缺少信号转导序列，故其多与其他受体联合引发信号转导。Aranzamendi等的研究证明ES抗原可以在体外条件下通过TLR4激活MYD88信号通路来压制DC成熟，但ES抗原作为一种复合抗原，很可能并非只通过一种受体识别[10]。血吸虫的研究发现血吸虫可溶性虫卵抗原可以利用MR下调炎症反应，这提示旋毛虫的Th2型偏转可能也利用MR[11]。在神经囊尾蚴病的研究中发现敲除MR基因的小鼠的生存率更高，这表明囊尾蚴可能利用MR乱来损伤宿主[12]。基于MR在其他寄生虫领域的研究，

在本研究中，体外应用ES抗原刺激BMDC，我们发现在感染初期，DC上的MR呈现下降趋势，这可能是由于DC利用MR介导吞噬ES抗原所导致。中后期DC上的MR逐渐上升，推测此时DC已逐渐成熟，抗原摄取能力逐渐降低，抗原递呈能力逐渐增强。在体内实验中我们发现感染第7-21天MR的表达均出现上调，这可能与旋毛虫的寄生部位主要在肠道有关。这表明MR在旋毛虫ES抗原混合对宿主的刺激中发挥了作用。第28天MR没有变化，但在35天却有上调，由于旋毛虫在21天后基本进入长期寄生状态，这可能是由于感染未成功或组内差异较大造成的。结合体内及体外实验，MR在旋毛虫感染过程中在MLN出现先下调后上调的趋势，推测可能DC利用MR识别ES抗原的甘露糖结构，这将有助于DC对ES抗原的识别。可能由于感染初期DC利用MR来识别ES抗原，导致受体下调后激活了机体免疫，上调了MR以便更好的识别抗原。但也不排除ES抗原利用MR抑制DC成熟。旋毛虫慢性感染可引起Th2型免疫反应，但其引发这种反应的具体机制还不清楚。MR作为模式识别受体，可以激活多种细胞因子的分泌变化，在抗原的识别和递呈中有着重要的作用。DU等的研究证明ES抗原可以利用MR通过Myd88途径激活细胞因子以减轻脓毒败血症的损害[13]。本研究发现在旋毛虫感染过程中，DC上 的MR参与了机体对旋毛虫的免疫反应。推测DC对ES抗原的吞噬作用可能依赖于MR的介导，但MR在旋毛虫感染中起到的具体作用还不清楚，有待于进一步研究。寄生虫病对畜牧业危害甚大，研制出有效的新型疫苗至关重要，但寄生虫病的疫苗研究却相对滞后。抗原的摄取与递呈是机体产生特异性免疫反应的关键，本研究可为旋毛虫病新型疫苗的研究提供一定的基础支持。

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(编辑：侯向辉)

Effect ofTrichinellaspiralisInfection on Mannose Receptor of Dendritic Cell on Mice

LIU Bo-yu， WANG Cheng，XING Xin，CHEN Hong-liang， JIANG Jing， CAI Ya-nan， ZHAO Quan，WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity；JilinProvincialEngineeringResearchCenterofAnimalProbiotics，Changchun130118，China)

To investigate the effect ofTrichinellaspiralisinfection on MR of dendritic cell(DC)in mesenteric lymph nodes(MLN)on mouse and with cultivation of mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) and pulsed ofTrichinellaspiralisexcretory / secretory (ES) antigens, The change of MR on BMDC was detected by FCM. The results showed that the MR receptor on the dendritic cells of MLN was down regulated in seventh days, but it was up-regulated in 14 days. The difference was significant (P<0.05).In virto experiments showed that MR was down regulated and it was up-regulated at 48 h, the difference was significant (P<0.05). This study proved thatTrichinellaspiralisinfection can cause changes MR on dendritic cells and it is indicated that MR may be the recognition receptor of ES antigen. With the research of dendritic cell vaccine, this study can provides support to DC vaccine of Trichinella spiralis and immune escape mechanism research of parasite.

MR；Trichinellaspiralis；dendritic cell

国家“863”计划项目(2013AA102806，2011AA10A215)；国家自然科学基金项目(31272552)

刘博宇，硕士，从事动物寄生虫免疫学研究。

杨桂连。 E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn。

2015-07-13

A

1002-1280 (2015) 10-0042-04

S852.7