甲病毒载体的研究进展

龚文芝，刘 灿，张东东，宁宜宝

（中国兽医药品监察所，北京100081）

甲病毒载体的研究进展

龚文芝，刘 灿，张东东，宁宜宝∗

（中国兽医药品监察所，北京100081）

甲病毒属于披膜病毒科，是一类有包膜的单股正链RNA病毒。近些年来，国内外有关甲病毒载体的研究非常活跃，其已被用于疫苗研究、基因治疗以及分子生物学等研究领域。基于甲病毒载体的构造原理，将其分为三类，分别为复制完全型载体、复制缺陷型载体和DNA／RNA载体。就这三类载体的改造过程进行了探讨，并对这三类载体的特点及其应用研究进展等方面进行了阐述，以期为开发出更安全、更有效的甲病毒载体提供参考。

甲病毒；复制子载体；高水平表达

甲病毒（Alphavirus）属于披膜病毒科（Togavirus family），是一类有包膜的单股正链RNA病毒，该病毒寄主广泛，由吸血昆虫或节肢动物叮咬易感脊椎动物而传播，目前已发现包括辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SINV）、塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）、委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalomyelitis virus，VEEV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等30个成员。甲病毒基因组5’末端的前2／3部分编码非结构蛋白，称为非结构区，该区共编码4种非结蛋白（nsp1～nsp4），而靠近3’末端的后1／3称为结构区，编码数种结构蛋白，这些结构蛋白由亚基因组mRNA翻译得到，其包括衣壳蛋白（C）、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6 K蛋白等。甲病毒在感染细胞过程中5’末端2／3的基因组RNA首先翻译，产生RNA复制和转录所需要的nsps，然后在nsps的作用下，启动子P26S启动亚基因组mRNA的转录，鉴于亚基因组mRNA的沉降系数为26S，因此该亚基因组的启动子命名为P26S。随后经过翻译，在病毒和宿主编码蛋白酶的联合作用下裂解为衣壳蛋白和膜糖蛋白，这些结构蛋白与病毒基因组RNA装配成核衣壳后以出芽方式释放［1］。

基于甲病毒的这些生物特性和复制特点以及甲病毒cDNA感染性克隆的建立，人们衍生出一些甲病毒表达载体，目前对辛德毕斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）的载体研究最为广泛。甲病毒载体主要分为三种：复制型载体、复制缺陷型载体和DNA／RNA载体，本文将分别对这三种载体的基本原理和特点以及其应用进行阐述，旨在为开发出更安全、更有效的甲病毒载体提供参考。

1 甲病毒载体的分类

1.1 复制完全型载体 甲病毒复制完全型载体系统一般由两个载体构成：一个为表达载体，其包含病毒RNA复制所必需的非结构蛋白病毒基因；另一个为辅助载体，其包含重组病毒颗粒的结构基因，如衣壳、膜蛋白基因和6K蛋白基因等。

这类载体本质上是重组后的病毒，转染宿主细胞后能产生子代病毒颗粒，能够自我复制。通过对该载体进行特异的突变、基因敲除或在病毒序列中适当位置引入外源基因，用以研究和阐明甲病毒的生物特性和分子机理。人们发现RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的出错率影响病毒RNA在复制过程中的突变率，进而影响病毒的感染和传播能力。Lark L Coffey等［2］在一株CHIKV的感染性克隆基础之上，将其基因组RdRp所在的nsp4非结构蛋白区域的单个氨基酸C483Y进行突变，该突变有利于抵抗病毒突变诱导剂的作用，实验发现该氨基酸突变的病毒突变体虽然在复制过程中确实保真性有所提高，但是在宿主蚊和新生小鼠体内与野生毒株相比感染能力、病毒滴度都有所下降。此外，如何控制复制完全型载体的复制与感染及其生物安全是用于疫苗研究亟需解决的关键性问题。

1.2 复制缺陷型载体 甲病毒复制缺陷型载体系统由两个载体构成，一个表达载体包含病毒RNA复制所必需的非结构蛋白病毒基因（nsp1－4）和插在甲病毒强亚基因组26S启动子之后的外源基因；另一个辅助载体只包含重组病毒颗粒的必需结构基因，如衣壳和膜蛋白基因等。

这类载体系统经共转染入宿主细胞完成包装之后能形成病毒颗粒，其不能自我复制但能感染宿主细胞，具有对宿主细胞的广泛嗜性并进行短暂高效的转基因表达，由于辅助载体缺乏该RNA包装信号，在宿主细胞内组装后的子代病毒不能自我增殖，导致重组的病毒颗粒表现为复制缺陷的特征，这种复制缺陷性载体又被称之为“自杀性载体”。这类载体保留了甲病毒的诸多良好的生物特性如广泛细胞嗜性、高水平表达等，表现为复制缺陷；然而该类载体虽然能够产生较高外源基因的瞬时表达且免疫效果良好，但是其成本昂贵，而且在宿主细胞内由表达载体和辅助载体转录出的两种RNA有可能发生重组从而产生完整的基因组导致病毒的传播。为了解决这一问题，人们采取了多种策略对这种缺陷型载体进行改造，使该类载体具备了良好的生物安全性。Berglund等［3］在SFV的p62早期蛋白中E2与E3膜蛋白剪切位点附近进行三个位点进行点突变，将重组产生复制型病毒的可能性控制在较低水平。随后，人们将辅助质粒的膜蛋白进行突变与单个辅助质粒拆分成多个辅助质粒的策略相结合，将这种重组可能性降到了极低的水平，理论上的重组概率只有4.2×10－17［4］。Kamrud等［5］发现通过缺失启动子P26S的辅助质粒不仅不影响缺陷性病毒样颗粒的产生，而且使重组产生复制完全型病毒的效率进一步降低。

1.3 DNA／RNA载体 DNA／RNA载体是以DNA为基础的甲病毒载体，这类载体携带病毒复制酶基因，将亚基因组启动子P26S之后的病毒结构蛋白由一段多克隆位点代替，并在该多克隆位点插入外源基因，随后借用甲病毒的复制酶以及甲病毒亚基因组启动子P26S的高效启动子，大量转录并翻译合成外源蛋白。

DNA／RNA载体在转染之前必须首先进行体外转录，制备5’末端含有帽子结构和3’末端含有PolyA尾的重组RNA；但是这种方法操作繁琐，产生的转录物容易降解。将真核表达元件如真核启动子、转录终止区等构建入甲病毒重组质粒可以有效解决这一问题。Kohno等［6］用人巨细胞病毒（CMV）早期启动子取代SFV载体原SP6启动子，并引入多聚腺苷酸尾；这种经过改造后的甲病毒载体避免了体外制备RNA繁琐的过程，并且以DNA的形式直接转染入动物细胞进行外源蛋白的表达。Chen等［7］将质粒pSFV1的启动子替换成人端粒酶逆转录酶启动子并且引入SV40poly（A）多聚腺苷酸尾，将改造好的质粒电转入沙门氏菌弱毒株SL7207，而该弱毒株类似“运载工具”能使质粒进入肿瘤细胞；体内外实验表明该靶向性的甲病毒复制子pShT－ePNP能够在肿瘤细胞内高效表达外源基因。这类载体一般在12 kb左右，笔者将构建带有EGFP荧光蛋白的该类载体采用不同公司的转染试剂进行转染，结果发现各种试剂转染效率都不高，正是由于较大的相对分子质量使得这类载体转染效率不高并且转染方法或试剂也会带来一些负面效果如间接抑制病毒复制、激活抗病毒细胞反应等等，由此运用新型的转染试剂或方法显得极为迫切。有研究发现一些短肽如细胞透膜肽（Cellpenetrating peptides，CPPs）可以作为有效载体以无毒副作用的方式来运输核酸透过细胞膜［8－9］。DNA／RNA载体由于不能产生病毒颗粒，丧失了对宿主细胞的广泛嗜性，也还能诱导宿主细胞快速凋亡，进一步影响外源蛋白的释放与折叠，从而可能会影响到免疫效果。

2 甲病毒载体的特点

2.1 高水平表达 甲病毒载体产生的重组RNA复制子在其导入细胞内之后能高水平复制，如基于SFV复制缺陷型载体产生的重组RNA在每个细胞内大概有2×105个拷贝。甲病毒载体对外源基因的表达性能比非复制子载体要高。任晓慧等［10］将表达生长激素释放激素（GHRH）的复制子载体pCMV－Rep－GHRH、普通载体 pIRES－GHRH和pCDNA3－GHRH转染293细胞，将这三种不同载体分别转染细胞，利用放射性免疫法（Radioimmunoassay，RIA）和RT－PCR对表达的GHRH进行定量分析，结果表明复制子载体表达外源基因的效率比非复制子载体高2～3倍。

2.2 增强免疫原性 甲病毒载体导入细胞之后，在细胞质中能够大量合成出正、负链RNA，从而形成大量的双链RNA复制中间体，其能够激活非p53依赖性的双链RNA依赖的蛋白激酶PKR和活化RnaseL导致细胞凋亡。细胞凋亡产生的凋亡小体能够被表面具有ανβ5受体的树突状细胞（DCs）以及其他一些抗原呈递细胞的摄取，提呈给CD8＋T细胞，可激发强而有力的细胞免疫［11］。甲病毒载体可诱导产生I型IFN，从而为表达抗原起到提供佐剂的效果。Leither等［12］用SIN DNA载体与普通载体分别在正常与敲除IFN－α／β受体的小鼠体内表达黑色素瘤抗原，实验发现该载体与普通载体在敲除IFN－α／β受体的小鼠体内都不能产生激活IFN－α／β途径的反应，而在正常小鼠体内，SIN载体能产生比普通载体更强的细胞免疫反应。Andrei Nikonov等［13］发现甲病毒的病毒复制酶只有在具有完整的RdRp活性时才能够诱导产生IFN－β，在甲病毒感染宿主细胞后，其病毒复制酶可以对病毒RNAs和细胞RNAs进行修饰，激活RNA解旋酶RIG－1和MDA5等分子，从而介导I型IFN基因的转录。

3 甲病毒载体在疾病防治和生物制药方面的应用

3.1 疫苗研究 复制完全型载体会引起生物安全方面的问题，由于插入外源基因导致其基因组大于野生型基因组从而容易呈现不稳定性，因此目前其主要用于甲病毒分机子机理方面的研究。复制缺陷型甲病毒载体，尤其是塞姆利基病毒和辛德毕斯病毒缺陷型以及近几年来出现的VEEV－SINV嵌合体，正变成快速和高水平的基因表达的工具。甲病毒复制缺陷型表达系统也已经被用来作为治疗与预防包括 HIV、Hendra和 Nipah许多病毒性疾病［14－15］。Vander Veen等［16］将猪流感病毒血凝素HA基因构建入复制缺陷型VEEV载体系统中，分别免疫实验动物小鼠和猪，实验证明高剂量的该疫苗免疫动物之后不但没有引起VEEV的散播，而且免疫之后没有出现毒力返强的现象，在免疫宿主猪时能够产生很强的体液反应、IFN－γ免疫反应和能够抵抗同源猪流感强毒的攻击。也有研究者将VEEV空壳粒子作为灭活流感病毒疫苗的佐剂分子，动物实验表明该空壳粒子能够明显提高灭活疫苗的免疫保护作用［17］。DNA／RNA载体在疫苗应用方面也很广泛。Cheng等［18］将兔出血热病病毒的VP60基因构建入，通过转染实验证实VP60基因得到表达，免疫兔实验表明该复制子疫苗能够诱导产生特异性的抗体和介导较强的细胞免疫反应，而且对致死毒量的攻击达到全保护。笔者将佐剂蛋白GP96N端（26AA－374AA）基因与猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因用linker串联之后构建入塞姆利基森林病毒复制子pSCA1中，探讨佐剂分子能否进一步提高免疫效果，目前对该构建完成的质粒进行免疫原性的研究中。Sun等［19］将SFV复制子元件和猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因构建入腺病毒骨架内构成新的嵌合载体疫苗，动物实验表明该疫苗解决了单纯采用甲病毒复制子疫苗和腺病毒疫苗免疫保护不完全的问题，具备良好的免疫原性，同时为新的疫苗设计提供了思路。

3.2 癌症研究 甲病毒载体在抗癌症研究中具有重大的潜力。甲病毒载体可以用来表达肿瘤抗原或者抗肿瘤蛋白，能杀死癌症细胞，而且甲病毒载体也能增强抗原表达和激发细胞凋亡机制［26］。采用甲病毒载体表达一些细胞因子如IL－12、IL－18、GM－CSF或者肿瘤相关抗原（Tumor associated antigens，TAAs）来作为疫苗已经成功运用到肿瘤动物模型；而且SINV具有对肿瘤细胞的自然嗜性，能够专性诱导肿瘤细胞凋亡［20－23］。 Tseng等［24］将自杀式基因hsvtk构建入SINV复制完全型载体的nsp3中，结果表明在前药苷昔洛韦的存在下，该载体能诱导肿瘤细胞凋亡，其一方面抑制辛德毕斯病毒在细胞内的增殖，另一方面有助于前药激活之后产生的毒力代谢产物扩散到周围未感染的肿瘤细胞，进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用。此外，基于VEEV的复制缺陷型载体疫苗治疗前列腺癌已进入I期临床实验［25］。

3.3 外源蛋白表达 哺乳动物细胞源的医用和兽用生物药品的数量与日俱增，而在生物制药方面，人们普遍认为生产外源蛋白有两种策略：采用稳定的细胞系和基因的短暂表达。市场上的这类生物药品全部来自与稳定的重组细胞系，由于瞬时基因表达过程能够在短时间内产生高水平的蛋白表达而成为研究的热点，而且病毒性的载体已经被大量运用于表达重组蛋白，其中复制缺陷型的塞姆利基病毒载体和辛德毕斯病毒载体由于良好的生物安全性、细胞的广泛嗜性和快速高水平的基因表达能力受到广泛青睐。许多不同的重组蛋白也已经在甲病毒载体中得到表达，这些重组蛋白包括功能性的膜蛋白、受体、酶以及病毒蛋白。修饰后的SFV载体在哺乳动物细胞内表达G蛋白偶联受体，能够达到10 mg／L和100～300 pmol／mg的总蛋白，相比稳定的细胞系和其他瞬时转染载体，采用塞姆利基病毒载体表达的产量是稳定的细胞系和其他瞬时转染载体的20多倍［26－27］。然而，这些表达的蛋白也还仅限于实验水平，需要进一步优化条件才能进行规模化生产，如降低病毒生产的费用，合适的生物反应器和感染病毒粒子之后的培育措施以及病毒粒子的定量方法等［28］。

4 展望

三类甲病毒载体都具有区别其他病毒或非病毒性载体的独特优势而且也各具千秋。目前，甲病毒载体已经在甲病毒分子机理、抗癌症研究和治疗许多病毒性疾病方面得到了广泛的应用，但是其潜力还没有得到充分的挖掘。开发可控型、具有靶向治疗效果的甲病毒载体和建立能够提高该类载体瞬时外源蛋白表达量的细胞系以及探究该类载体的临床实验效果等都是今后努力的方向。相信随着对甲病毒载体研究的不断深入，该类载体在有效性和安全性方面将进一步提高，从而为未来对抗疾病提供有力的生物学工具。

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（编 辑：李文平）

Review on Alphavirus－based Vectors

GONG Wen－zhi，LIU Can，ZHANG Dong－dong，NING Yi－bao∗
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

Alphaviruses belong to the family ofTogaviridae，which are encapsulated by a capsid protein and possess single strand plus RNA.In recent years，the domestic and foreign research on alphavirus－based vectors is active and the alphavirus－based vectors have been used for vaccine research，gene therapy and molecular biology research.Based on the structural principle，the alphavirus vectors are classified into three main types：replicationcompetent vector，replication－deficient vectors and DNA－layered vector.In this review，the transformation，characteristics and application of three different alphavirus－based vectors are discussed in order to provide references for the development of safer，more effective alphavirus－based vectors.

alphaviruses；replicon－based vectors；high－level expression

2014－12－03

A

1002－1280（2015）04－0065－05

S852.65＋9.6

龚文芝，硕士研究生，从事兽用疫苗研发工作。

宁宜宝。E－mail：ningyibao＠ivdc.org.cn