猪传染性胃肠炎病毒S基因在昆虫细胞中的表达

武 岳，周金龙，张超林，张许科，*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州450002;2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳471003)

猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissible gastroenteritis，TGE)是猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)引起猪的一种严重腹泻、呕吐和脱水等主要临床症状的高度接触性传染病，各种年龄的猪对该病均易感，其中2周龄以内的仔猪死亡率高达100%，是威胁养猪业发展的主要病毒性疾病［1］。近年来，该病有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行。且该病的临床症状和流行病学与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、猪 轮 状 病 毒(Porcine Rotavirus，PRV)、猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)引起的疾病非常相似，传统的血清学方法很难将其区分，这就大大增加了临床诊断的难度，因此建立相应的实验室诊断方法势在必行。

TGEV主要编码4种结构蛋白，其中S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能够诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。因此，S基因是TGEV基因工程疫苗研究的重要候选基因，S基因所表达的蛋白在决定病毒的亲嗜性、致病性和血凝性等方面起着非常重要的作用［2－5］。研究表明，S 蛋白含有 A、B、C、D 4 个抗原位点［6］，在S蛋白的4个抗原位点中，A、B和D位点高度保守，A、D位点在诱导中和抗体的产生起着非常重要的作用［7］。其中，D位点在病毒的增殖过程中也起到一定的作用。另外，PRCV在基因组结构上与TGEV具有较高的同源性［8］，TGEV S基因A抗原位点是TGEV和PRCV的保守序列［9］，而D位点在PRCV中缺失，可用于这两种疾病的鉴别诊断。因此，本研究选择了TGEV S基因编码A、D抗原位点的片段进行了表达，以便为TGE诊断方法的建立提供物质材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株及细胞 TGEV毒株(ATCC®VR－1740TM)、Sf9细胞由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 Bac－to－Bac®HBM －TOPO®Secreted Expression System kit、Cellfectin®II Reagent、Sf900 II SFM、HiPure Plasmid Miniprep Kit，Invitrogen公司;Viral Nucleic Acid Extraction kit，Geneaid;Reverse Transcriptase XL(AMV)、Prime STAR®HS DNA Polymerase，大连宝生物工程有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技有限公司;去糖基化酶PNGase F，NEB公司;DAB显色试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司;HRP标记兔抗猪 IgG、FITC标记兔抗猪IgG，Sigma公司;猪传染性胃肠炎阳性血清，美国VMRD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank公布的TGEV全基因序列(登录号:EU074218)设计一对引物F和R。引物序列为:F:5’－ATGTCATTGAACACAACGGGT－3’;R:5’－TAAGCCACTAAGTAGC GTCCT－3’，扩增产物大小为1056 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 RT－PCR扩增目的基因 提取 TGEV的RNA，利用引物 R进行 cDNA的制备。然后以cDNA为模板扩增S基因编码A、D抗原位点的片段。PCR反应条件为:95℃预变性3 min;95℃变性30 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环后，72℃延伸10 min。然后将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收目的片段。

1.2.3 重组 Bacmid的获得 根据Bac－to－Bac®HBM－TOPO®Secreted Expression System kit操作说明书，将回收产物直接克隆到pFastBacHBM－TOPO载体中，菌液PCR初步鉴定正确后，提取质粒进行序列测定，测序正确的质粒命名为pFast－S;然后将pFast－S转化DH10Bac感受态细胞，经三重抗性(卡那霉素、庆大霉素、四环素)蓝白斑筛选后，利用试剂盒中提供的pUC/M13引物进行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，将阳性重组质粒命名为Bacmid－S。

1.2.4 重组杆状病毒的制备、扩增及鉴定 将获得的重组质粒Bacmid－S转染至Sf9昆虫细胞，同时设置正常细胞对照。当细胞发生明显病变时，收集上清液，即为P1代重组杆状病毒。然后根据试剂盒说明书进行蚀斑实验测定重组病毒滴度，按照MOI=0.1将P1代重组杆状病毒［VML=(MOI×细胞总数)/病毒滴度］接种到细胞密度为2×106/mL的Sf9细胞中，27℃培养至出现细胞病变为止，收集上清即为P2代毒。同样的方法接种P2代毒，收集P3代毒，用于蛋白的表达。提取P3代重组病毒核酸，利用目的基因上下游引物F/R进行重组病毒的PCR鉴定。

1.2.5 重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达 将悬浮培养的Sf9细胞状态调整至对数生长期后用于重组病毒的表达。接种前进行活细胞计数，将细胞密度调整至2×106/mL，按MOI=5接入P3代毒，同时设置正常细胞对照，置于27℃的摇床中，110 r/min培养48～72 h，收集上清。

1.2.6 间接免疫荧光(IFA)鉴定表达产物 在6孔细胞培养板上，将P3代重组杆状病毒接种于预先长满单层的Sf9细胞，培养至发生病变时用间接免疫荧光法(IFA)检测重组蛋白的表达，具体步骤为:吸去细胞上清，用 PBS 液(0.01 mol/L、pH 7.4)洗涤细胞3次，用80%丙酮固定细胞20 min;然后用PBS洗3次，加入猪传染性胃肠炎阳性血清37℃孵育1 h;再用PBS洗3次，加入FITC标记兔抗猪IgG 37℃孵育50 min，最后用PBS洗3次置于荧光显微镜下观察结果。

1.2.7 Western blot鉴定重组蛋白 将P3代重组病毒感染Sf9细胞，72 h后收集感染上清，同时收集正常Sf9细胞作为阴性对照进行SDS－PAGE电泳，用半干电转移法将PAGE凝胶中的蛋白转印至硝酸纤维素(NC)膜上，进行Western blot鉴定。将转印有蛋白的NC膜用封闭液4℃封闭过夜后，加入猪传染性胃肠炎阳性血清(1∶200稀释)37℃孵育1.5 h;PBST漂洗3次后，加入HRP标记的兔抗猪IgG(1∶2000稀释)37℃孵育1 h;再用PBST漂洗3次后用DAB显色试剂盒显色2～3 min，观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 RT－PCR扩增目的基因 RT－PCR扩增S基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1056 bp左右的特异性条带，与预期大小一致(图1)。

2.2 重组Bacmid的鉴定 用pUC/M13引物对重组质粒进行PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在3556 bp处有一条电泳条带，与预期结果相符，表明重组Bacmid构建成功(图2)。

2.3 重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞 在转染试剂Cellfectin®ⅡReagent介导下，将重组质粒 Bacmid－S转染融合至95%的Sf9昆虫细胞，72 h后在显微镜下观察细胞病变，结果发现细胞肿大，细胞核增大，折光性增强，随着感染时间的延长，细胞开始从底部脱落悬浮到培养基中(图3A)，而正常Sf9细胞无此变化(图3B)，表明重组病毒拯救成功。

图1 S基因的PCR扩增结果

图2 S基因重组Bacmid的PCR鉴定结果

图3 重组Bacmid转染Sf9细胞显微观察图(200×)

2.4 RT－PCR鉴定重组病毒 提取P3代重组病毒的核酸，用目的基因上下游引物F/R进行RTPCR鉴定，电泳条带为1056 bp，与预期目的基因大小一致。

2.5 IFA鉴定重组蛋白的表达 经IFA鉴定，感染Bacmid－S的Sf9细胞中具有明显的特异性荧光(图4A)，而Sf9对照细胞没有荧光(图4B)，结果表明S蛋白在Sf9细胞中得到了表达。

图4 S蛋白的间接免疫荧光鉴定结果

2.6 Western blot鉴定表达产物 转印结果显示，表达产物在蛋白分子质量约为55 kD左右出现了一条特异性条带(图5A)，表明S蛋白在昆虫细胞中得到了表达。用去糖基化酶PNGase F处理重组蛋白后，Western blot结果显示在43 kD左右处出现了与预期理论值大小相符的条带(图5B)，表明昆虫细胞对其表达的外源蛋白进行了糖基化修饰。

3 讨论

目前，用于蛋白表达的系统很多。大肠杆菌等原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工修饰，影响其在诊断试剂抗原和疫苗制备等方面的应用。酵母表达系统虽然能够对外源蛋白能进行糖基化修饰，但具有局限性［10］。而杆状病毒表达系统对表达产物可以进行磷酸化、糖基化等一系列的翻译后加工修饰［11］，另外杆状病毒严格的宿主特异性，决定了它不能感染脊椎动物细胞，因此重组杆状病毒不会对人和环境造成危害［12］，对畜禽无致病性［13］，在疫苗生产药物开发等方面具有更好的应用前景［14］。所以，杆状病毒表达系统成为研究者们首选的真核表达系统［15］。

本研究采用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统，将含有A、D抗原位点的S基因片段直接克隆入pFastBacTMHBM－TOPO载体，经转座、转染后获得重组杆状病毒。与其它杆状病毒表达系统如Bac－N－Blue系统相比，避免了重组病毒蚀斑筛选纯化的步骤，大大缩短了重组病毒的产生周期。此外，pFastBacTMHBM－TOPO载体中含有蜂毒素信号肽序列，该序列为一分泌信号，保证了所表达的重组蛋白能够有效的分泌到细胞外介质中，这就增强了正确的二硫键的形成，同时降低了蛋白酶对表达蛋白的降解，还可以显著减少杂蛋白的水平，简化后期纯化过程。

目的蛋白的表达水平除了受基因性质的影响外［16］，还与转染效率密切相关［17－18］。转染细胞的种类、用于表达的细胞种类、接种病毒时细胞的生长状态和密度、接毒剂量以及收毒时间等均可影响目的蛋白表达量。对转染条件及表达条件进行优化可获得稳定高效的表达。本研究采用能够生产高滴度病毒的Sf9昆虫细胞进行转染，为了产生高滴度的重组病毒，本试验选择在250 mL或500 mL的三角瓶中悬浮培养昆虫细胞，使悬浮细胞有更多的空间与病毒接触，当细胞活率大于95%时调整细胞密度到2.0×106～2.5×106/mL进行重组蛋白的表达，接毒后细胞死亡率达到70% ～80%时收获病毒液，发现此时收获的病毒表达量最大。而且所表达的蛋白以可溶性的形式存在于感染细胞的上清中，为后期诊断抗原制备提供了方便和可行性。

Western blot显示的条带相对分子质量(55 kD左右)比理论值(43 kD)偏大，经糖基化位点预测软件，目的蛋白含有10个N－糖基化位点，19个O－糖基化位点，可能是昆虫细胞对其表达的外源S蛋白进行了糖基化修饰的结果［19－20］，因此增大了目的蛋白的分子量。本研究目的蛋白在昆虫细胞中的成功表达，为TGE诊断抗原的研制及免疫预防的研究奠定了基础。

［1］殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.第2版.北京:科学出版社，1997:681－690.

［2］Di－Qiu Liu，Xin－Yuan Qiao，Jun－Wei Ge，et al.Construction and characterization of Lactobacillus pentosus expressing the D antigenic site of the spike protein of transmissible gastroenteritis virus［J］.Canadian Journal of Microbiology，2011，57(5):392 －397.

［3］Abid Nabil Ben Salem，Chupin Sergei A，Bjadovskaya Olga P，et al.Molecular study of porcine transmissible gastroenteritis virus after serial animal passages revealed point mutations in S protein［J］.Virus Genes，2011，42(2):212 －219.

［4］Ortego Javier，Sola Isabel，Almazán Fernando，et al.Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence［J］.Virology，2003，308(1):13－22.

［5］Ballesteros L，Sanchez C，Enjuanes L.Two amino acid changes at N－terminus of TGEV spike protein result in the loss of enteric tropism［J］.Virology，1997，227(2):378 －388.

［6］Delmas B，Rasschaert D，Godet M，et al.Four major antigenic sites of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus located on the amin o － terminal half of spike glycoprotein S［J］.Journal of General Virology，1990，71:1313－1323.

［7］Nogales A，Galán C，Márquez－ Jurado S，et al.Immunogenic characterization and epitope mapping of transmissible gastroenteritis virus RNA dependent RNA polymerase［J］.Journal of Virological Methods，2011，175(1):7－13.

［8］Kwon H M，Saif L J，Jackwood D J.Field isolates of transmissible gastroenteritis virus differ at the molecular level from the miller and purdue virulent and attenuated strains and from porcine respiratory coronavirus［J］.J Vet Med Sci，1998，60(5):589 －597.

［9］张春叶，孙英健，沈 红，等.猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达［J］.中国兽医科学，2008，38(6):510－513.

［10］Lakey D L，Voladri R K，Edwards K M，et al.Enhanced production of recombinant Mycobacterium tuberculosis antigens in Escherichia coli by replacement of low － usage codons［J］.Infection and Immunity，2000，68(1):233－238.

［11］凌 同，余 黎，白幕群.昆虫杆状病毒表达系统的研究进展与应用［J］.微生物学免疫学进展，2014，42(2):70－77.

［12］刘春菊，任炜杰，王志亮.杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2013，40(9):101－104.

［13］孙新宽，宋丽丽，韦 平，等.昆虫杆状病毒表达系统在病毒性家禽疾病研究中的应用进展［J］.中国家禽，2014，36(1):39－43.

［14］李晶梅.昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的研究进展［J］.中国兽药杂志，2012，46(12):67－70.

［15］刘高强，章克昌，王晓玲，等.昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展［J］.中国生物工程杂志，2004，24(7):40－44.

［16］杨 雷，谢红玲.共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定［J］.中国兽药杂志，2013，47(12):13－16.

［17］秦志华，张明宇，张传美，等.猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析［J］.中国兽医杂志，2014，50(7):22－24

［18］范学政，徐 璐，赵启祖，等.猪瘟兔化弱毒E2基因重组杆状病毒的构建及抗体制备［J］.中国兽药杂志，2015，49(1):6－9.

［19］李建强，柳纪省，程 杰，等.猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析［R］.生物技术通报，2009，4:95－98.

［20］Fandan Meng，Zeping Zhao，Guangxing Li.Bacterial expression of antigenic sites A and D in the spike protein of transmissible gastroenteritis virus and evaluation of their inhibitory effects on viral infection［J］.Virus Genes，2011，43:335 － 341.