1株鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和HA基因序列分析

钟植文，冼望强，黎先伟，何柳芬，刘 薇，杨傲冰*

(1.广东永顺生物制药股份有限公司，广州511356;2.广东省动物防疫物资储备中心，广州510520)

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，分高致病性和低致病性两种，低致病性以H9亚型禽流感为主［1］。目前国内养鸡场多常用BJ94类，如F、SS、SD696等毒株的疫苗，起到一定的预防作用，但未能达到100%的完全保护，仍有 H9亚型禽流感发生［2－3］。2013年冬，广东珠三角地区某鸡场的肉鸡群发病并出现死亡，发病前4天死亡率共计超过1%。本试验从发病肉鸡群中采样，经病毒的分离、鉴定，确定为H9亚型禽流感病毒。对分离株的HA基因进行序列测定和分析，并与近年流行的H9亚型禽流感毒株和部分常用疫苗毒株HA基因、蛋白进行相似性比较和分析，旨在从分子水平上了解广东地区目前H9亚型禽流感病毒的毒力特点，为该病的预防和控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样本 于2013年采自广东珠三角地区某鸡场的发病肉鸡群。

1.1.2 试验动物 10日龄SPF鸡胚由广东永顺生物制药股份有限公司提供。

1.1.3 试剂 新城疫病毒、减蛋综合症病毒、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、H5、H7、H9标准阳性血清购自广东省动物防疫监督所;MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M － MLV 反转录酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq购自 TaKaRa(大连)公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离和传代 采集发病鸡的气管、肺脏等脏器，研磨后冻融3次，3000 r/min离心8 min，上清液经细菌滤器过滤除菌。滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚8只，0.2 mL/只，接种后置37℃温箱孵化，弃去24 h内死亡鸡胚，每天照胚三次，将死亡鸡胚置于4℃冰箱，至第96 h将全部鸡胚置于4℃冰箱。观察死亡鸡胚病变，收获死亡鸡胚和冻死鸡胚尿囊液，并作无菌检查，然后连续传代。

1.2.2 血凝试验和血凝抑制试验 参照文献［4－5］配制1%鸡红细胞悬液，取分离株鸡胚尿囊液进行微量血凝试验;然后具有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合症病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清进行微量血凝抑制试验。

1.3 基因型鉴定

1.3.1 引物设计 根据该毒株的初步实验结果，从GenBank上获取多株H9亚型AIV基因序列分析比较后，使用 DNAStar(Verison4.0)和 Primer Premier(Verison5.0)针对HA基因核苷酸序列的保守区域设计了1对特异性引物，用于扩增包含HA基因的核苷酸片段，所设计引物送上海英骏生物有限公司按照PAGE级别合成。引物序列如下，HA1:AGCAAAAGCAGGGG;HA2:AGTAGAAACAAGGGTGTT，预计扩增1700 bp。

1.3.2 RT－PCR 反应 用 Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分离株鸡胚尿囊液的病毒总RNA，用随机引物为反转录引物合成cDNA，再用针对H9亚型禽流感病毒HA基因所设计的特异性引物进行PCR扩增检测，将RT－PCR扩增产物电泳检测结果。

1.3.3 序列测定和分析 扩增产物经回收纯化后送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定，将测得的序列提交NCBI BLAST SERVER进行联机检索。应用DNAStar软件分析HA蛋白裂解位点的氨基酸序列、受体结合位点以及潜在的糖基化位点，并利用 MEGA 5软件绘制系统进化树。从GenBank上获得 BJ94、SS、F、SD696 等疫苗毒株以及近年来流行毒株的HA基因核苷酸序列(表1)，结合本试验分离株的相应序列，利用DNAStar软件包中的MegAlign程序中Clustal W方法进行相似性比较。

2 结果

2.1 病毒分离和传代 经处理的病料接种10日龄SPF鸡胚，96 h内均未出现死亡，收获冻死鸡胚尿囊液，无菌检查为阴性。

2.2 血凝试验和血凝抑制试验 分离株的鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞，表明其对鸡红细胞具有血凝性，血凝效价(HA)为1∶256。而新城疫病毒、减蛋综合症病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清对分离株的血凝抑制效价(HI)分别为 ＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、1∶256，证明分离到的病毒株为禽流感病毒H9亚型，命名为A/chicken/Guangdong/JL/2014(简称为JL)。

2.3 RT－PCR扩增结果 利用特异性引物对JL株的RNA进行RT－PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得与预期大小一致的目的片段(图1)。

2.4 HA基因序列的测定及遗传进化分析 序列测定后，将JL株的HA基因序列经NCBI BLAST SERVER检索，结果显示其与GenBank上的RZ853株的核苷酸序列相似性最高，达到97%。利用DNAStar软件对JL株的HA基因序列进行分析，结果表明其HA基因含有一个长度为1683个核苷酸的完整ORF，预计编码560个氨基酸。推导的氨基酸序列分析表明，当中含有8个潜在的糖基化位点，依 次 为:29NST、141NVS、145NGT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。受体结合位点的氨基酸分别为:109Y、161W、163T、191N、198T、202L、203L，即除了198位氨基酸有所变化外，其它位点均很保守;而其226位氨基酸为L，为哺乳动物受体结合位点的特征氨基酸。裂解位点(335～341位)的氨基酸序列为RSSR↓GLF，裂解位点附近均无连续碱性氨基酸插入，仅能被有限的细胞蛋白酶识别，符合低致病性禽流感病毒的分子特征［6－7］(表2)。基于JL株与GenBank中的H9亚型禽流感毒株分群参考毒株、国内常用疫苗株以及近年来流行毒株的HA基因核苷酸序列，利用MEGA5.2软件绘制系统进化树(图2)。遗传进化分析结果表明，JL株属于4.2.5分支，与RZ853株的亲缘关系最近，与GX55、LG1等近年来流行毒株处于同一进化分支;而国内常用疫苗株F、SS、SD696与BJ94株同属4.2.3分支。分离的JL株所处的4.2.5分支和SS株等常用疫苗株所处的4.2.3分支同属4.2这一大分支，但两个分支之间有一定的遗传距离［8－9］。

图2 分离株的HA基因的系统进化树

表2 JL株与各参考毒株HA蛋白关键位点的比较

2.5 HA基因和蛋白序列相似性分析 利用DNAStar软件包中的MegAlign软件对JL株HA基因核苷酸、蛋白氨基酸序列与GenBank上获得毒株的相应序列进行相似性比较。结果表明，JL株HA基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列与RZ853株等国内近年流行的4.2.5分支H9亚型禽流感病毒的相似性较高，分别为90.9% ～97%和94.3% ～99.5%，而与国内常用疫苗株 F、SS、SD696 等 4.2.3 分支毒株的相似性较低，分别为88.4% ～89.6%和90.7% ～91.4%。由此可见，同属4.2 分支的 4.2.5分支(JL株等流行株为代表)和4.2.3分支(SS、F株等常用疫苗株为代表)之间存在了一定的差异。

3 讨论

3.1 JL株的分离鉴定 本试验从发病鸡群中分离到JL株，它对鸡红细胞有血凝性，而凝集可被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清所抑制，测序结果分析显示，JL株的HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF，符合低致病性毒株的分子特征，证明JL株为H9亚型禽流感病毒低致病力毒株。

3.2 HA基因分析 裂解位点、受体结合位点和抗原位点都位于血凝素HA蛋白中，选用HA基因来分析H9亚型禽流感病毒的致病性、宿主特异性、抗原性以及遗传变异等情况，可得到较为可靠的分析结果。受体结合位点方面，JL株及近年来的流行株HA蛋白的第226位氨基酸均发生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突变，呈现出典型的人流感病毒受体结合特性，这提示H9亚型禽流感病毒不经中间宿主适应就能直接感染人类的趋势更明显，在未来可能对公共卫生安全构成巨大威胁［10］。至于潜在糖基化位点，JL株相比 F、SS等疫苗株发生了 S145N、T220I、P315S等突变，导致缺少 218NRT、增加了145NGT、313NGT潜在糖基化位点。145NGT的出现造成病毒不与抗H9N2的单克隆抗体F6、2A4发生反应，直接导致病毒致病性和抗原性的改变［11］;但其它两个突变对于抗原性有多大影响，目前尚未清晰。基于JL株HA基因序列的系统进化树表明，JL株属于4.2.5分支，而国内常用疫苗株F株、SS株、SD696株与BJ94株同属4.2.3分支，JL株所处的4.2.5分支和疫苗株所处的4.2.3分支虽然同属4.2这一大分支，但两个分支之间有较明显的遗传距离和差异。本次分离的JL株和当前的流行株类似，均与疫苗株有一定的核苷酸、氨基酸序列以及抗原性差异，当前使用的疫苗株不一定能够提供100%的完全保护。

3.3 H9的防控 当前一些肉鸡场有H9亚型禽流感的暴发和流行，不能够完全归结为毒株变异、抗原性改变而使现有的疫苗不能完全保护，在多数情况下可能还与饲养环境、管理水平、免疫失误等原因有关。毕竟商品肉鸡生长周期短，免疫器官发育尚未成熟，接种灭活疫苗并未能迅速产生有效保护力，加上灭活疫苗主要诱导机体产生循环抗体，免疫鸡群可能缺乏足够的分泌型抗体，从而对粘膜的保护效果较低。如果饲养环境差，病原复杂，管理水平低，应激因素多，均会加重疫情。因此，要结合隔离、消毒等生物安全措施以及规范饲养管理来综合防治，并适当结合应用有效的优质灭活苗(含有4.2.5分支毒株)进行补免，这有可能减少H9亚型禽流感的发生，或者降低其危害。

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