人白细胞介素-15的高效表达

许崇利，惠远峰，谢 莹，许崇波

(1.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林吉林 132022;2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062;3.大连大学医学院，辽宁大连 116622)

白细胞介素 -15(Interleukin-15，IL-15)是Grabstein[1]于1994年发现的一种细胞因子。与IL-2具有类似的生物活性。它能促进T细胞，NK细胞和B细胞的增值和分化，诱导淋巴细胞产生IFN-γ及 TNF-α的作用[2]。近年来的研究表明，IL-15在抗肿瘤、抗微生物感染和治疗艾滋病等方面均有重要的作用[3-5]。人体多种组织和细胞均可表达IL-15，其中骨骼肌、胎盘、肾脏、骨髓基质细胞及脂多糖刺激的外周血单核细胞表达较丰富。另外，IL-15有其自身高亲和力的特异性受体IL-15Rα，IL-15与其受体IL-15Rα的亲和力是IL-2与IL-2 Rα的1000倍[2]，将有可能代替IL-2成为抗感染、抗肿瘤强有力的生物制剂。而且天然IL-15产量低、不易大量制备，为此我们构建了表达IL-15蛋白的基因工程菌株，实现了高效表达，并对其表达条件进行了优化研究，从而为IL-15生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。

1 材料和方法

1.1 菌株 含IL-15基因的重组菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，由吉林化工学院基因工程实验室构建。

1.2 试剂 限制性核酸内切酶(NcoI、EcoR I)，标准蛋白分子量，购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒，购自Promega公司。

1.3 重组菌株的酶切鉴定 质粒DNA的酶切鉴定按文献[6]介绍的方法进行。

1.4 IL-15基因表达条件的优化

1.4.1 不同pH值培养基对IL-15基因表达的影响 将LB液体培养基的pH值分别调为6.5、7.0、和7.5，然后分装于200 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，按1%的接种量接种重组菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，于37℃ 160 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

1.4.2 不同培养温度对IL-15基因表达的影响将LB液体培养基的pH值调整至7.0，然后分装于200 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，按1%的接种量接种重组菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，分别于35℃、37℃和39℃ 160 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

1.4.3 不同菌体密度对IL-15基因表达的影响按1.4.2方法制备LB液体培养基和接种，于37℃160 r/min培养，分别于菌体密度OD600达到0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

1.4.4 不同IPTG诱导浓度对IL-15基因表达的影响 按1.4.2方法制备LB液体培养基和接种，于37℃ 160 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.5 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

1.4.5 不同诱导时间对IL-15基因表达的影响按1.4.2方法制备LB液体培养基和接种，于37℃160 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L 的 IPTG，分别于1、2、3、4、5 h取样，进行蛋白表达检测。

2 结果

2.1 IL-15基因的鉴定 首先用质粒试剂盒提取重组质粒pET28c(+)-IL-15，重组质粒经限制性核酸内切酶NcoI/EcoR I酶切后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，在约360 bp处有一条带，与预期的IL-15基因片段相一致。同时对重组质粒进行核苷酸序列测定，结果证实与GenBank报道的序列一致且阅读框架正确，从而成功地构建了含IL-15基因的表达质粒pET28c(+)-IL-15(图1)。

图1 重组质粒pET28c(+)-IL-15的酶切电泳结果

2.2 不同pH值培养基对IL-15基因表达的影响不同pH值的培养基对IL-15蛋白表达水平有明显影响，其中培养基pH值为7.0时，IL-15蛋白表达量最高，且位于低分子量蛋白Marker 16 ku处，与预期的IL-15蛋白分子量相一致，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，IL-15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的27.2%(图2)。

图2 不同pH值的培养基对IL-15基因表达的影响

2.3 不同培养温度对IL-15基因表达的影响不同的培养温度对IL-15蛋白表达量也有较大的影响，当培养温度为37℃时IL-15蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，IL-15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量28.1%(图3)。

图3 不同培养温度对IL-15基因表达的影响

2.4 不同菌体密度对IL-15基因表达的影响当培养基的菌体密度OD600达到0.4时，IL-15蛋白表达量开始显著增加，当菌体密度OD600达到1.0时，IL-15蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，IL-15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的28.6%(图4)。

图4 不同菌体密度对IL-15基因表达的影响

2.5 不同IPTG诱导浓度对IL-15基因表达的影响 不同的IPTG浓度对IL-15蛋白表达量的影响不同，当IPTG浓度达到1.0 mmol/L时IL-15蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，IL-15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的27.5%(图5)。

图5 不同IPTG诱导浓度对IL-15基因表达的影响

2.6 不同诱导时间对IL-15基因表达的影响随着诱导时间的增加，IL-15蛋白表达量也逐步增加，当IPTG诱导时间为3 h时，融合蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，IL-15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的30.3%(图6)。

图6 不同诱导时间对IL-15基因表达的影响

综上所述，重组菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)优化表达条件是:培养基pH值7.0、培养温度37℃、IPTG诱导浓度1.0 mmol/L、菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG、诱导时间为3 h，此时表达效果较理想。

3 讨论

IL-15是一个促炎性细胞因子，在天然免疫系统中发挥重要作用。现已证实有多种组织表达IL-15受体。IL-15通过与其受体结合首先激活JAK1/3，进而使 STAT3/5/6磷酸化诱导下游基因。IL-15可以激活src相关的酪氨酸激酶，诱导Bcl-2表达，激活Ras/Raf/MAPK途径最终活化fos/jun[7]，在某些细胞中还可以激活 NF- κB。IL-15通过其受体激活下游基因表达，进一步调节细胞的生理功能。研究表明IL-15参与许多疾病的发病，如自身免疫及炎症性疾病、结节病、多发性骨髓瘤、免疫排斥等[8]。因此深入研究IL-15有利于阐明一些疾病发病机制、诊断及治疗。

研究从人外周血中克隆了IL-15基因，构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，实现了在大肠杆菌中的高效表达。外源基因的表达水平不仅涉及到宿主、载体和外源基因三者之间的关系，而且受到所处环境的影响[9]。对于各种影响因素的优化组合，可以通过每次改变一个因素或者同时改变几个参数来进行[10]。本研究中，我们固定其它参数，而对单个因素加以优化，从而获得整体的优化[11]。

通过改变参数，从而找到最佳表达条件，其优化表达条件是:培养基pH值7.0、培养温度37℃、IPTG诱导浓度1.0 mmol/L、菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG、诱导时间为3h。从而为其生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。

[1]Grabstein K H，Eisenman J，shaneborok K，et al.Cloning of a novel T cell growth factor which interacts with the β chain of the IL-2 recepeor[J].Science，1994，26(4):965.

[2]Eisenman J，Ahdieh M，Beers C，et al.Inerleukin-15 interactions with inerleukin-15 receptor complexs:charact-erization and species specificity[J].Cytokine，2002，20(3):121-129.

[3]Jakobisiak M，Golab J，Lasek W.Interleukin 15 as a promising candidate for tumor immunotherapy[J].Cytokine Growth Factor Rev，2011，22(2):99-108.

[4]Giron-Michel J，Azzi S，Khawam K，et al.Interleukin-15 is a major regulator of the cell-microenvi-ronment interactions in human renal cancer[J].Bull Cancer，2011，98(5):32-39.

[5]Matsumoto K，Kikuchi E，Horinaga M，et al.Intravesical interleukin-15 gene therapy in an orthotopic bladder cancer model[J].Hum Gene Ther，2011，22(11):1423-1432.

[6]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning[M].2nd Ed，New York:Cold Spring Harbor Labora-tory Press，1989:1-50.

[7]Torelli G F，Guarini A，Maggio R，et al.Expansion of natural killer cells with lytic activity against autologous blasts from adult and pediatric acute lymphoid leukemia patients in complete hematologic remission[J].Haem atologica，2005，90(6):785-792.

[8]McInnes I B，Gracie J A，Harnett M，et al.New strategies to control inflammatory synovitis:interleukin 15 and beyond[J].Ann Rheum Dis，2003，62(Suppl 2):51-54.

[9]饶桂荣，陈文吟，栗宽源，等.重组人抗HBsAg单链抗体的中试发酵工艺研究[J].中国生化药物杂志，2005，26(3):141-143.

[10]许崇利，许崇波，惠远峰，等.A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXMCPA02表达条件优化[J].中国兽药杂志，2009，43(11):21-24.

[11]许崇利，谢 莹，许崇波，等.人γ干扰素的高效表达[J].中国兽药杂志，2010，44(11):17-21.