UPLC和HPLC法检测猪肉中磺胺类药物残留的比较

罗成江，陈慧华，林仙军，韦敏珏，周 炜，应永飞

(浙江省兽药监察所，杭州 310020)

超高效液相色谱(UPLC)技术是近年来发展较快的新型液相色谱检测技术，采用了2.0 μm以下颗粒度的色谱柱填料，能够获得更高的柱效，并且在更宽的线速度范围内柱效保持恒定，因而有利于提高流动相流速、缩短分析时间和提高分析通量。相对于传统HPLC而言，UPLC具有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度，为复杂体系的分离分析提供了良好的技术平台[1]。

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是常用的广谱抗菌药。因其具有抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉等特点，在动物养殖中被广泛使用。人类经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品，可能引起磺胺类药物在体内的逐渐累积.其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用以及激素样作用等[2-3]。目前中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物。其最大残留限量一般为50～100 μg/kg。本文采用农牧发[2001]38号动物源食品中磺胺类药物残留的检测方法[4]，分别在UPLC仪器和HPLC仪器上同时对磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺喹恶啉(SQ)5种磺胺在猪肉中的残留量测定，并比较2种方法测定结果。结果表明HPLC分析方法能够成功地转换并优化为UPLC方法，既达到了样品分析的高通量又得到更高的分析灵敏度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1100高效液相色谱仪-UV检测器，Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm);Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪-UV检测器，Waters Acquity UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。XS-205 电子天平(Mettler公司);SL502 N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);3k30型冷冻离心机(Sigma公司);N-EVAPTM112型氮吹仪(美国Organomation公司);20通道固相萃取装置(Waters公司);MS2 minishaker涡旋混匀器(IKA公司)。色谱纯乙腈，甲醇;分析纯磷酸，正己烷，正丙醇，无水硫酸钠;去离子水。磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑标准品:购自SIGMA公司，含量均不少于99%。固相萃取柱:Waters Sep-Pak碱性氧化铝柱，2 g/12 cc。

标准储备液的配制(500 μg/mL):分别准确称取磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑50.0 mg(准确至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为500 μg/mL，置于4℃冷藏避光保存。

混合标准工作液:分别精密量取1.00 mL 5种磺胺类药物标准储备液，用甲醇定容至100 mL，浓度为5 μg/mL的标准工作液，置于4℃冷藏避光保存。

1.2 样品前处理

1.2.1 制样 取适量空白猪肉样品绞碎匀浆，作为空白试料，添加适宜浓度的标准浓液，作为空白添加试料。

1.2.2 提取与净化 称取组织样品5 g(精确到0.1 g)，加入乙腈25 mL，无水硫酸钠少许，涡旋震荡15 s后，以4000 r/min的速度离心5 min。上清液移至分液漏斗中，分离后的残渣再用25 mL乙腈提取处理，涡旋震荡15 s后，以4000 r/min的速度离心5 min。合并两次的上清液，加入正己烷30 mL毫升，振摇2 min后，静置分层，取下层液体，加入正丙醇10 mL，50℃下减压浓缩至近干，残留物用95%乙腈3 mL溶解，过Waters Sep-Pak碱性氧化铝柱(预先经5 mL 95%乙腈活化)。用95%乙腈5 mL淋洗，再用70%乙腈10 mL洗脱后，洗脱液中加入5 mL正丙醇，50℃下减压浓缩至近干，残留物用2.0 mL流动相溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液作为试样溶液，供液相色谱仪进行检测。

1.3 分析条件

1.3.1 HPLC色谱条件 色谱柱:Waters symmetry C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2 ∶2∶9 ∶0.2)，流速1 mL/min，检测波长270 nm，柱温30℃，进样量50 μL

1.3.2 UPLC色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，流动相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2∶2∶10∶0.2)，流速0.4 mL/min，检测波长270 nm，柱温30℃，进样量 5 μL。

1.4 测定法 取适量相应浓度的标准液和试样溶液注入液相色谱仪，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量。标准工作液及试样中磺胺类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样液测定过程中要参插注入标准工作液，以便准确定量。

2 UPLC方法学考察

2.1 线性关系考察 精密量取标准工作液适量，加甲醇稀释制成为 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 μg/mL的标准溶液。按设定色谱条件进行线性分析，以溶液浓度(μg/mL)为X，以峰面积为Y，绘制标准工作曲线。结果表明，各种化合物的质量浓度在10～500 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.9990。

2.2 仪器精密度试验 取50 ng/mL对照品溶液，在UPLC仪器上重复进样6次，各磺胺类药物峰面积的RSD为0.5%。表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液5 μL，分别于 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 进样，测得各药物峰面积的RSD为0.5%。

2.4 添加回收率的验证 取空白样品试料分别向其中加入 50 μg/kg、100 μg/kg 和 200 μg/kg 浓度的磺胺类药物混合标准溶液。进行提取、净化及色谱分析。每个添加水平作5份平行测定，结果表明:平均回收率为70.5% ～101%，相对标准偏差为4.9% ～11.0%，结果见表1。

表1 猪肉中5种磺胺类药物的添加回收率和精密度

3 猪肉中磺胺类药物残留在HPLC和UPLC中的测定结果比较

取同一批号的空白猪肉样品，加适量混合标准工作液，使磺胺类药物的加标浓度为100 μg/kg，按1.2.2项下的方法处理后，按各自液相色谱检测条件检测磺胺类药物的残留量。每个浓度点取5份样品，求其平均回收率。结果表明，UPLC和HPLC方法所测得的猪肉中磺胺类药物残留量的测定结果一致，结果见表2，色谱图比较见图1和图2。

图1 磺胺类药物残留测定的HPLC图谱

图2 磺胺类药物残留测定的UPLC图谱

表2 UPLC与HPLC仪测定猪肉中磺胺类药物残留结果比对

4 讨论

4.1 流动相的选择 以UPLC法考察不同比例的各溶剂系统，结果发现将流动相:乙腈 -甲醇-水-乙酸(2∶2∶9∶0.2)调整为乙腈-甲醇-水-乙酸(2∶2∶10∶0.2)时，分离度及峰形更好。

4.2 小结 本试验中以UPLC法测定猪肉中磺胺类药物残留的检测按农牧发[2003]1号《兽药残留试验技术规范(试行)》进行了方法学研究，符合要求。本试验根据农牧发[2001]38号测定项下方法，比较了UPLC法与HPLC法磺胺残留测定结果，可看出两法测定结果误差在规定范围以内。UPLC法具有快速、高分离度等优势，将HPLC定量方法转换并优化为UPLC方法，在保证含量测定结果准确的前提下，将提高色谱峰分离度，减少溶剂损耗及废液处置费用，减少分析时间，降低分析成本，提高了分析通量。

[1]Wirth M J.Mass transport in sub-2- μm high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2007，1148(1):128.

[2]段振娟，张鸿雁，王 硕.动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J].食品研究与开发，2007，28(6):149-152.

[3]万春花，龙洲雄.磺胺类药物残留的色谱分析进展[J].现代科学仪器，2008，18(2):99-104.

[4]农业部动物性食品中兽药残留检测方法标准汇编[S].北京:中国农业科学技术出版社，2009:179-183.

[5]农业部.农业部文件农牧发[2003]1号.关于发布《兽药残留试验技术规范(试行)》的通知[S].