高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中大环内酯类药物残留

高 玲，张 丹，曹 军，郭 栋，杨瑞章，于伯华

(1.盐城出入境检验检疫局检测中心，江苏盐城 224002;2.江苏出入境检验检疫局，南京 200001)

抗生素在畜禽养殖业中广泛的作为治疗药物使用，在众多抗生素类药物添加剂中，大环内酯类抗生素占有较为重要的地位[1]。抗生素残留是指因动物在接受抗生素治疗或食入抗生素饲料添加剂后，抗生素及其代谢物在动物的组织及器官内蓄积或贮存。食品残留发生急性中毒的可能性极小，这种长期、低水平的接触方式主要产生各种慢性、蓄积毒性，如“三致(致癌、致畸、致突变)”、免疫毒性、发育毒性和生态毒性等，对健康和环境的危害往往具有隐蔽性，易造成实质性和难以扭转的危害[2]。

目前，国外对动物性食品中大环内酯类抗生素的残留检测开展的比较广泛，已有较多文献对此进行了研究与探讨，而国内相关检测文献较少，仅有少数有关HPLC分析某一种大环内酯[3-4]或LCMS/MS进行大环内酯多残留检测[5-6]的报道，但目前国内液质联用法测定大环内酯类药物残留的研究报道较少。本文通过对比3种水产品中不同的大环内酯类类药物提取方法，最终利用乙腈超声提取，能够快速简便地检测水产品中的10中大环内酯类药物。大量的进出口水产品样品检测结果表明，该方法能够满足目前进出口已经国家残留监控的标准。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料 Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra液相色谱-高分辨串联四极杆质谱联用仪，配有电喷雾电离源。

甲醇、乙腈 (色谱纯，Merck)，甲酸(色谱纯，Fluka)，碳酸钠、碳酸氢钠 (分析纯，南京化学试剂厂)，水为重蒸蒸馏水。

螺旋霉素Ⅰ(Spiramycin I SPR)、替米考星(Tilmicosin TIL)、林可霉素(Lincomycin LINCO)、红霉素(Erythromycin ERM)、罗红霉素(Roxithromycin ROM)、泰乐菌素 A(Tylosin TYL)、吉他霉素(Kitasamycin KIT)、交沙霉素(Josamycin JOS)、竹桃霉素(Oleandomycin OLE)、克林霉素 (Clindamycin CLN)购自Sigma-Aldrich公司，纯度＞98%。

标准储备液:称取适量的标准品，使用甲醇溶解，得到质量浓度为100 mg/L的标准储备液。

标准工作溶液:使用甲醇-水(体积比为3∶7)稀释标准储备液至所需的质量浓度。

水产品样品为各地送检样品。

1.2 HPLC-MS/MS条件 HPLC条件:Hypersil Gold C18 色谱柱 (100 mm ×2.1 mm，5 μm);流动相A相为甲醇，流动相B相为0.1%甲酸水溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脱程序见表1;柱温为室温;进样体积为20 μL;分析时间为12 min。

表1 大环内酯类药物色谱分离的线性梯度洗脱程序

MS/MS条件:电喷雾离子化源，正离子方式检测;10种大环内酯类药物质谱定性定量数据见表2。1.3 样品提取 准确称取组织(鮰鱼、龙虾)样品(5.00±0.05)g于50 mL离心管中，加入相应浓度的混标涡旋20 s，加入20 mL乙腈提取液，涡旋后超声提取15 min，再加入4 g无水硫酸钠旋涡3 min，离心(3500 r/min，10 min)，残渣用 10 mL 提取液再提取一次，合并滤液。于水浴旋转蒸干，准确加入1.00 mL甲醇水混合溶液(体积比2∶8)和0.5 mL正己烷涡旋后高速离心(12000 r/min，10 min)脱脂，取下层清液过0.45 μm的滤膜到进样瓶中，准备进样。

表2 10种大环内酯类药物的母离子和选择离子及碰撞能

2 结果与讨论

2.1 提取和净化方式的选择 大环内酯类抗生素为弱碱性化合物，易溶于酸性水溶液和极性溶剂，如甲醇、乙腈等[7]。在中性水溶液中相对较稳定，但酸性条件下易发生水解，特别是红霉素，即使很稀的醋酸溶液也能使其分解。根据文献[8-9]报道，采用酸化的甲醇溶液提取，结果表明，林可霉素、红霉素、螺旋霉素和阿奇霉素的回收率均小于60%，可见这4种化合物的酸解较为严重。本研究采用乙腈提取，正己烷净化[10]，10种大环内酯类化合物均得到较好的回收率，且前处理步骤简单。

本文还对比了液-液萃取和固相萃取方法。液-液萃取的方法简单方便，但杂质较多。固相萃取方法相对成本较高但提取和净化一步完成有利用于实现自动化操作。水产品样品用0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH=9.3)缓冲溶液提取，然后在Oasis HLB柱上净化。大环内酯类药物在酸性条件下(pH＜4.0)不稳定，而在碱性条件下(pH=9.3)提取，既可以避免药物分解，又可以使带氨基的药物保持分子形式，提高药物的固相萃取回收率和稳定性，发现获得的回收率与上法相差不大。考虑到乙腈直接提取方法在大环内酯类药物提取上已经能够获得足够的回收率，且可以较大降低检测成本，因此后面都采取了乙腈直接提取的前处理方法。

2.2 色谱和质谱条件的优化 在正离子模式下，分别对1 mg/L的10种大环内酯类抗生素的标准溶液进行母离子全扫描，确定其分子离子，优化各分子离子的锥孔电压。再分别以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子，丰度最大的作为定量离子，并优化其碰撞能量。10种大环内酯的优化质谱条件见表2。

不同的色谱柱对同一样品有不同的保留时间。实验使用几种不同的反相色谱柱进行分离，结果发现:在现有的色谱洗脱条件下，Thermo Fisher公司的 Hypersil Gold C18柱(100 mm ×3.5 mm，5 μm)由于填料颗粒细，使峰形更加对称尖锐，信噪比更高，因此本文最终选择该色谱柱作为分离柱。在流动相中加入适量的甲酸(0.1%)，可以提高灵敏度。在现有的色谱条件下进行色谱分离，10种大环内酯类分析物，除了林可霉素保留时间较小，其余9种大环内酯药物保留时间均在6～8 min内，在2 min左右全部被洗脱下来，且大部分色谱峰重叠在一起，每个色谱峰的底宽约14 S，见图1。为了使每一个色谱峰有足够的扫描点(duty cycle)，优化了质谱参数。在1.2项的优化条件下，每个子离子的扫描驻留时问为5 ms，每个子离子切换时间为3 ms，每个分析物色谱扫描点在25个以上，保证每个色谱峰有良好的重现性。

2.3 方法的定性、定量、线性范围、回收率和精密度 进行样品测定时，若样品的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测物进行监测的全部特征离子的相对丰度应与标准品一致，离子丰度与浓度接近的标准溶液偏差在规定范围内[11]，则可判断样品中存在对应的被测物。采用不含大环内酯类药物的龙虾、鮰鱼为样品基质空白，制备 5、10、20、50、100、200 μg/kg 的 10 种抗生素样品的混合标准系列标准液，进样测定。以标准品与内标物峰面积比值Y为纵坐标，工作溶液的质量浓度X(μg/L)为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液的响应值均在仪器测定的线性范围内。在5～200 μg/kg范围内10种抗生素标准曲线线性均为良好，线性相关系数R＞0.99。由下表可以发现，本实验用于提取基质中的大环内酯类抗生素的方法，回收率稳定在60% ～120%之间;日内精密度小于11%，完全满足日常分析检验的需要。对阴性龙虾和鮰鱼进行加标实验(5、20、50 μg/kg)，数据及计算结果如表3和表4所示。

图1 空白龙虾样品中添加10种大环内酯类抗生素的选择离子色谱图(加标水平5 μg/kg)

表3 龙虾加标回收率和精密度

表4 鮰鱼加标回收率和精密度

3 结论

建立了HPLC-MS/MS同时测定水产品中10种大环内酯类药物残留的检测方法。采用乙腈做溶剂，超声提取，进一步有效去除基质干扰，方法快速简洁，灵敏度、检出限、精密度等指标均满足国内外相关法规的要求，可为水产品中大环内酯类抗生素残留的监督检验和残留监控提供技术支持，适合大量进出口水产品中大环内酯类药物的检测。

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