浅析动物源细菌抗生素耐药性的现状与对策

周 炜，陈慧华，周芷锦，鲁马媚，穆 琳，应永飞

(浙江省兽药监察所，杭州 310020)

2010年，一种可抗绝大多数抗生素的超级细菌在英国、美国印度等国家爆发，一度引起全球性恐慌。一时间，亚洲国家对抗生素的不正当使用，成为众矢之敌。尽管尚无明确证据表明人源细菌耐药性来源于动物源细菌，但公众已然将矛头直指兽用抗生素的滥用。当前形式下，如何正确地认识并了解动物源细菌耐药问题已然成为关系到人类自身安全和畜牧业健康发展的重要问题。

1940年，青霉素刚开始投入临床时的药敏实验显示，所有金黄色葡萄球菌(简称“金葡菌”)均对其敏感。自1942年，Ramel-kamp和Maxon首次报道出现对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌后[1]，科学界就对细菌耐药性形成机制、耐药性监测等诸多问题进行了深入研究。基于对人类自身安全及我国畜牧业的健康发展因素的考虑，我国于20世纪90年代就开始了对动物源细菌耐药性的研究，主要针对重点养殖区的动物源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的耐药性。2000年中国兽医药品监察所开展了对华东地区鸡源和猪源性大肠及沙门氏菌的耐药性背景调查。2008年我国开始建立了由中国兽医药品监察所、辽宁、上海、四川、广东省(市)兽药监察所和中国动物卫生与流行病学中心组成的动物源细菌耐药性监测系统，3年间主要开展了对大肠杆菌、沙门氏菌对14种抗菌药物敏感性的研究，并已取得初步进展。本文简要介绍了细菌耐药性的形成与传播途径，就动物源细菌耐药性的现状及危害问题，提出了几点针对性建议，并简要总结了我国动物源细菌耐药性研究的进展。

1 细菌耐药性形成与传播

细菌耐药性又称细菌抗药性，系指细菌对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。

耐药性根据其发生原因可分为天然耐药和获得性耐药。天然耐药又称固有耐药，不是通过细菌基因的改变，而是由于细菌自身独特的细胞表面结构、对化学药物具有特殊的代谢或流出途径、对化学药物降解酶具有特殊的生物合成途径等因素而形成的对抗生素的天然耐药[2-4]。例如大肠杆菌和沙门氏菌由于其细胞膜具脂多糖厚的特点，而对大环内酯类药物具有天然耐药。获得性耐药，则是细菌通过基因突变或水平基因转移而获得。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株则大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。

耐药性细菌可从人、动物和食品中分离得到，因而细菌耐药又可分为动物源、食源和人源三种。2011年5月～7月在德国、西班牙、法国等欧盟国家爆发的肠出血性流行病就是食源致病菌—肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠黏附性大肠杆菌(EAEC)，经德国斯特大学的研究小组研究发现，这两种致病菌对所有种类的青霉素及头孢菌素均有耐药性。值得注意的是，动物源细菌耐药并非指耐药菌株的耐药基因来源于动物源细菌，而系指从动物体内、体表分离得到的菌株具有耐药性。

1.1 细菌耐药性的形成机制 抗菌药物产生抗菌作用的两个必要条件是:抗菌药物的有效作用浓度、抗菌药物与作用靶位的结合。因而微生物耐药的作用机制可分为分为细菌酶对抗生素进行修饰使其失活、减少抗生素进入、增加抗生素流出[5-7]以及改变或置换抗菌药物作用靶位等机制。

抗生素的失活与修饰是细菌通过获得编码水解或修饰抗生素的酶的基因而产生的耐药性，迄今为止，已发现并证实细菌中存在190多种β-内酰胺酶，可以破坏青霉素或其它β-内酰胺酶类抗生素[8]。有研究表明，2010年引起全球性恐慌的超级细菌就是因其形成了编码新德里金属蛋白酶-1(New Delhi-Metallo-1，NDM-1)的基因，能对多种抗生素进行修饰。减少抗生素进入类耐药主要是细菌通过改变细胞膜通道蛋白或改变膜(荚膜、外膜等膜结构)的理化性状而获得的耐药性。因流出系统而获得的耐药则较为复杂，主要作用机制是通过质子力或ATP水解泵出膜通道两种，此类耐药与天然耐药性及多重耐药性有关。抗菌药物作用靶位的改变或置换主要与细菌内基因改变有关，如GyrA基因突变导致氟喹诺酮类药物与作用靶位结合率降低而形成的耐药[9]。

1.2 细菌耐药性的获得与传播 细菌主要通过基因突变及水平基因转移两种方式获得耐药性，获得的耐药性又可通过垂直和水平传播两种途径进行传播。基因突变(DNA/RNA的突变)是细菌在外因的诱导下自发进行的。尽管发生频率较低，但在优胜劣汰的自然选择下，突变优势通过亲代与子代菌株之间的垂直传播得以几何倍增。

水平传播则又可分为转化、接合和转导三种[10]。转化发生在一些链球菌、弯曲杆菌上，这些细菌可从环境中摄取由死菌体细胞释放出来的游离的耐药DNA片断，这些DNA片断在内化后，可整合到受体染色体上，也可作为染色体DNA自我复制。接合是耐药基因片段以自动转移质粒或可移动质粒为载体由供体菌向受体菌转移的过程，而转导则是以噬菌体介导转移。水平传播可能发生在不同菌属之间。这些质粒、整合子或转座子常携带多个耐药性标记，大质粒常传递多种耐药性机制，形成多重耐药[7]。

2 动物源细菌耐药性的危害

大量研究表明，1700多种感染性微生物中近50%是动物源性的[11]。同时，与人源性耐药菌相比，动物源病原菌耐药谱广、耐药强度强，因而动物源细菌耐药性危害性更强。

国际上对动物源细菌耐药危害性的调查研究可上溯到20世纪60年代。1969年英国联合委员会(UK Joint Committee)发布了Swann报告，警告食品动物使作亚治疗剂量抗菌药物用作促生长剂造成的耐药菌可能危及人类健康。自此，诸多发达国家开始着手对动物源细菌耐药性进行监测及流行病学调研[12]。1997年日本发生了引起人们极大恐慌的O157大肠杆菌风波及沙门氏杆菌食物中毒事件，后经证实与动物源致病菌的耐药性有关，动物源细菌耐药性对人类健康的直接危害首次得以确认[13]。

3 动物源细菌耐药性的检测方法

目前，动物源细菌耐药性的研究方法主要依据临床和实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制订的《动物源细菌的抗微生物药物纸片扩散法和稀释法敏感度试验执行标准;认可标准——第三版》进行体外细菌培养药敏性试验。纸片扩散法是将含有抗生素的纸片贴于接种了被检菌的琼脂平板表面，在培养一定时间后测量抑菌圈直径，因不同直径处药物浓度无法准确测定，故主要作为定性试验。肉汤稀释法和琼脂稀释法的检测原理相似，都是向培养基中加入已知浓度的特定抗生素，用以确定最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)，因而可作为半定量分析。E-Test作为一种改良型纸片扩散法，是将一定浓度梯度的抗生素附着于薄膜试纸上，因而能根据开始出现抑菌圈的试条位置确定MIC。根据CLSI的解释，上述四种药敏检测方法仅限于标签范围内使用的治疗性抗菌药物，对于预防及促生长用的抗菌药物、抗菌药物标签外使用(诸如:改变用药范围、使用剂量、给药途径等使用情况)，因其使用效果与体外药敏试验结果的关联度无法评估，而不适用。

近年来，随着基因技术的发展，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、基因芯片等针对特定耐药基因片段的研究正逐步兴起，突破了常规方法对被检菌生长速度的限制这一技术瓶颈，为耐药菌分型、耐药性基因的溯源研究提供了技术平台，但亦存在只能检测已知耐药基因、基因与表型不一致造成假阳性等局限性。

由于以上检测均为被检菌的体外药敏试验，因而依然存在假性耐药和假性敏感的可能，假性耐药即[2]:有些抗菌药在体外药敏试验呈耐药，但在被检菌宿主体内仍具抗菌活性的现象;假性敏感即:某一特定抗菌药物在体外试验中对某些确定的细菌有抑菌或杀菌活性，但在临床治疗上是无效的，例如第一代和第二代头孢菌素和氨基糖苷类对沙门氏菌Salmonella spp.均呈现假性敏感[14]。

4 动物源细菌耐药性的现状及发展趋势

随着规模化、集约化养殖的迅猛发展，畜禽养殖业对抗生素的过度依赖，致使了细菌耐药性问题日趋严重。与此同时，由于存在“耐药性出现→过量使用或滥用抗菌药物→耐药谱或耐药水平加重”这一恶性循环[12]，致使动物源细菌耐药性问题不断恶化。就全球范围而言，动物源细菌耐药性总体表现出如下几大特点:

4.1 细菌耐药性产生迅速 目前，国际上新兽药的研发期平均为10年，而细菌产生耐药性仅需2年。1940年，青霉素刚开始投入临床时的药敏实验显示，所有金黄色葡萄球菌均对其敏感。1942年，Ramel-kamp和Maxon报道出现对青霉素耐药的金葡菌，其实际出现时间应为1941年。1984年氧氟沙星上市不久，美国、法国、德国、日本等国家就报道有耐药菌株出现。安普霉素在兽医临床上使用不到两年就出现耐药大肠杆菌、沙门杆菌[13]。

4.2 多重耐药性上升 宋立等[15]对326株20世纪70年代至本世纪初分离保存的大肠杆菌对氨苄西林、庆大霉素等20种抗生素的耐药性进行了试验，结果表明:70年代大肠杆菌耐药1～7种，80年代的则耐1～9种，而90年代90%以上的大肠杆菌耐4～11种，到2000年96%的大肠杆菌则能耐8～16种。潘志明等[16]对1962～1998年间分离保存的325株鸡白痢沙门氏杆菌进行耐药性测定，发现其耐药谱不断增宽，70年代四耐、五耐菌株居多，80年代五耐、六耐、七耐菌株占绝大多数，90年代七耐以上菌株比例近90%。

4.3 耐药强度不断增强 细菌耐药性另一重要指标就是耐药菌株的MIC。随着耐药性的产生，养殖户盲目加大用药量，促使致病株耐药强度不断增加。敏感型大肠杆菌对喹诺酮类药物(氧氟沙星)的 MIC≤2 μg/mL[14]，雷连成等分离得到 MIC 为256 μg/mL 鸡致病性大肠杆菌[17]。

4.4 耐药性传播速度加快 20世纪60年代首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，80年代这一菌系便遍布全球。如今，随着全球交通、物流的大发展，使得耐药菌株耐药性的传播速度不断提高。2007年耐碳青霉烯肺炎雷伯氏菌在美国弗吉尼亚州爆发，至2010年，该耐药菌便在巴西、以色列等国相继爆发。

5 动物源细菌耐药问题的对策

5.1 正确认识细菌耐药性 就整体而言，我国畜牧业从业人员素质不高，对如何科学、合理使用抗菌药物缺乏相应的专业技术知识。由于兽医临床和饲料添加剂中抗生素用量、种类、范围不断增加和扩大导致动物源性细菌耐药问题日趋恶化，加之一些兽医和饲料添加剂生产商非法使用或添加仅限于人用的抗生素，进一步加重了动物源细菌耐药性对人类健康的威胁。因而，首先必须加强广大畜牧业从业人员及相关管理人员对动物源细菌耐药问题的严重性和紧迫性的认识，从源头上减少耐药性产生的条件。

在经历了耐药菌恶性爆发的事件后，细菌的耐药性已有让人谈虎色变之嫌。但是，事物均有两面性，我们在看到细菌耐药问题严重性的同时，还应当从另外两个方面正确认识细菌耐药性。①微生物产生耐药性并非都是坏事，如人体内正常菌丛，其产生的耐药性在保护自身的同时，也能确保不易发生菌群失调，不给真菌等条件致病菌以可乘之机。②并非所有抗生素均会迅速产生耐药性。临床上，根据抗微生物药物发生耐药性的可能性，抗生素可分为高耐药可能性药物和低(或无)耐药可能性药物[2]，前者临床应限制使用，如氨苄西林、庆大霉素、四环素、环丙沙星;后者临床可不限制或优先使用，如阿米卡星、多西环素、头孢吡肟等。因而，并非所有抗生素不能用，有针对性的正确使用还是可行的。

5.2 加强对兽用抗菌物的管理 我国兽医领域尚未建立处方药与非处方药制度，是抗菌药不合理使用、滥用和非法使用重要原因，建议今后应将抗菌药物列入处方药的规范管理，只有兽医师有才权使用抗菌药，保障原则上尽量选用窄谱抗菌药物，并尽可能地尽早根据药敏试验选药。与此同时，还可采取限用策略，如轮作制，即将一类抗菌药停用一段时期后再用，以恢复细菌对该类药物的敏感性。在人兽共用抗菌药方面，我国各级管理机构应当严格控制人用抗菌药在畜牧业上的使用，尤其是新型抗生素，以切断耐药性的传递途径。

5.3 开展深入持久的动物源细菌耐药性监测 就国家层面而言，开展动物源细菌耐药性的监测工作势在必行。通过统一的具可比性的方法在全国或重点代表性区域开展耐药性调查研究，掌握我国目前抗菌药耐药性的流行情况，为各级畜牧业行政主管部门制定抗菌药物管理政策提供数据支撑;通过建立健全动物源细菌耐药性风险评估体系，为预防及控制耐药性致病菌的大规模爆发提供科学依据。

6 我国动物源细菌耐药性研究进展

综上所述，国内外科学界已对动物源细菌耐药性的产生及危害、检测方法等诸多方面进行了多年深入研究。尽管，国内学者对动物源细菌耐药性的研究不断取得突破性进展，但与国外同行相比，仍处于起步阶段。如需果要建立细菌耐药性风险评估体系，为实际预防及控制耐药性致病菌的爆发提供数据支撑，还需要更为长期、覆盖面更广的细菌耐药性监测。此外，在耐药菌株亚型定型及溯源等更为深入的探索，亦有待国内研究者的不懈努力。

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