禽养殖场中季铵盐抗性菌株的分离及其 I类整合子特性研究

刘学禄,张宏梅,谢丽斯

(广东工业大学轻工化工学院,广州 510006)

细菌耐药性问题已经引起人类普遍关注,“超级细菌”的出现再次向人类滥用抗生素敲响了警钟。以往人类把细菌耐药性的研究重点多集中在临床致病菌上,对于环境中微生物的耐药监测研究材料相对缺乏。近年来,越来越多的研究人员开始关注非临床环境的微生物的耐药性及其在耐药性传播中的作用。尤其是在畜牧养殖中,消毒剂及抗生素的滥用造成动物源食品中出现大量的耐药性微生物,并有可能通过食物链进行传播,对人类的健康造成一定的威胁。整合子细菌耐药性在耐药性的传播中起到重要的作用,它是一种能识别并捕获外源性可移动基因、具有位点特异性的基因重组系统。整合子通过位点特异性基因重组机制使细菌耐药基因盒整合在一起,形成多种耐药基因的组合和排列,导致不同的耐药基因在共居一个系统的微生物群落间相互传播[1]。研究动物源食品中耐药微生物整合子的特征,对于当前研究食物链中微生物耐药性的传播,尤其是多重耐药性有着非常重要的意义。本文对一畜牧养殖场分离的 22株耐药微生物的 I类整合子及其整合的基因盒进行了检测,并分析了整合子对细菌耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 培养基 LB肉汤培养基,用于细菌的培养。季铵盐抗性菌株筛选培养基,在 LB培养基中添加浓度为 25μg/mg的苯扎溴铵。

1.2 菌株的筛选与鉴定 样品来源于广州一养殖场的鸡粪样品、鸡食槽料、鸡场土壤和水样。在选择培养基上生长的菌株经过重复划线纯化后,进行革兰氏染色、接触酶实验、氧化酶实验、葡萄糖产气实验、H2S实验、靛基质实验、柠檬酸盐实验、葡萄糖酸盐的氧化实验、甲基红实验、尿素酶实验、苯丙氨酸实验、赖氨酸及鸟氨酸实验,共分离鉴定 22株菌。

1.3 药敏检测 采用 K-B法进行药敏试验。普通琼脂和水解酪蛋白 Mueller-Hinton(MH)琼脂,由广东工业大学食品与生物工程系生物工程实验室配制。选用 10种常用抗生素：氨苄西林、头孢噻吩、氯霉素、复方新诺明、四环素、链霉素、磺胺、庆大霉素、卡那霉素、壮观霉素,以上抗生素纸片购自杭州天和生物试剂有限公司。实验用标准对照菌株与检测菌株平行测定,质量控制对照菌株为大肠杆菌 ATCC25922(CMCC44113),购自中国药品生物制品检定所。药敏方法和结果判断参照美国临床实验室标准化委员会标准(CLSI)[2]。

1.4 PCR法检测第 I类整合子 采用 PCR方法检测第一类整合酶基因(intI)和耐药基因盒,PCR为50μL体系,引物序列、总体积组成及扩增条件参照文献[3],引物由 TAKARA生物公司合成。产物用琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)溶液染色,在凝胶成像系统照相检测。采用的阳性对照和阴性对照由华南理工大学石磊教授所赠。

1.5 耐药基因盒的序列分析 扩增后的耐药基因盒序列检测由上海英俊生物技术有限公司完成,使用 Genetyx-version7.0软件以及在 www.ncbi.nlm.nih.gov网站对序列进行分析,应用 Nucleotide BLAST对获得的基因片段进行同源性检索。

2 结果

2.1 菌株的筛选鉴定 通过生化分析实验,菌株初步鉴定为 14株大肠杆菌、6株沙门氏菌、2株产气肠杆菌。

2.2 菌株对抗生素的敏感性实验 22株菌的药敏实验结果(图 1)表明,每株菌至少对 3种抗生素耐药,其中耐复方新诺明的菌株最多,22株(100%),耐氨苄西林的菌株有 18株(81%),耐四环素的菌株有 16株(72%),耐磺胺的菌株有 16株(72%),耐链霉素的菌株有 14株(65%),耐卡那霉素的菌株有 12株 (54%),耐氯霉素的菌株有 12株(54%),耐壮观霉素的菌株有 10株(46%),耐庆大霉素的菌株有 10株(46%),耐头孢噻吩的菌株有 6株(27%)。

图1 22株菌的药敏实验结果

2.3 第 I类整合子的检测结果 22株菌扩增第 I类整合酶基因(intI)的凝胶电泳结果表明,全部得到923 bp的扩增产物,大小与整合子相关文献报道相同[4],均鉴定为第一类整合子阳性菌株。

2.4 耐药基因盒序列分析 22株菌耐药基因盒特异性引物扩增整合子可变区的结果表明,只有 11株检测到耐药基因盒。其中,从 8株菌扩增得到1803 bp的 PCR产物,对 1803 bp片段进行测序,序列分析表明该片段与耐药基因盒 dfrA12+orfF+aadA2(GU001949,57～1859 bp)100%同源,其中dfrA12是编码对甲氧苄啶药物产生耐药的基因,aadA2是编码对氨基糖苷类抗生素产生耐药的基因。对于 orfF是一未知的基因盒,未有报道其编码的产物。从 8株菌扩增得到 1570 bp的 PCR产物,对 1570 bp片段进行测序,序列分析表明该片段与耐药基因盒 aadA5和 dfr17(AB188270,47～1616 bp)100%同源,该耐药基因分别对氨基糖苷类抗生素和甲氧苄啶药物产生耐药。从 2株菌扩增得到419 bp的 PCR产物 (与 AP006725,1823390～1823784 bp 100%同源),经分析得知其是一种 ATP依赖型蛋白,其功能是编码微生物对热产生抗性[5]。从 4株菌扩增得到 155 bp的 PCR产物(HM569736,1054～1206 bp 100%同源),经序列分析为耐药基因盒的整合位点,为重复序列和反向重复序列,可见是空基因盒。

3 讨论

由于在 I类整合子的结构中,3'保守片段均含有一个 qac△E,其对季铵盐类药物产生抗性[6]。本研究采用一定浓度的季铵盐药物培养基,目的是能更加高效地筛选到整合子阳性的多重耐药的菌株。实验结果证明,筛选得到 22株菌,I类整合子均为阳性。可见,菌株对季铵盐药物的表现型和整合子结构所在的基因型是相符合的。

本实验中发现的第一类整合子的分析显示,在 8株菌的 1570 bp耐药基因盒中含有 aadA5和 dfr17耐药基因盒,是编码抗壮观霉素、链霉素和复方新诺明的耐药基因。在 8株菌的 1803 bp耐药基因盒中含有aadA2和dfrA12耐药基因盒,是编码抗壮观霉素、链霉素和复方新诺明的耐药基因。另外,4株携带空耐药基因盒、2株携带抗热性基因的菌株,由于其具有整合子的结构,所以含有 3'保守端的sulI,该基因编码产物对磺胺类药物产生耐药[6]。在药敏试验中,16株菌耐四环素、18株菌耐氨苄西林,但未检测到其相关的耐药基因盒。其原因可能在于相关耐药基因并不在整合子上,有待于对其进行进一步的研究。

本实验中所用菌株均分离自环境,检测第一类整合子的阳性率为 100%,表明这些菌株面临着相对较高的抗生素选择压力。近年来,对整合子系统介导的细菌耐药已经成为研究的热点。在国外,研究者不仅从临床菌株,而且从环境和牲畜分离的菌株中都检测到整合子介导细菌耐药性的存在[7-8]。环境中整合子阳性菌株的出现,对人们合理应用抗生素和积极监测细菌耐药性提出了更高的要求。耐药菌株通过食物链进行传播,并有可能在人体内进行积累,为传染病的暴发及流行提供了可能性。本研究提示人类,不仅应从表型上,更应该从基因水平上全面系统地开展对细菌的耐药性监测。

[1] 戴晓莉,苏兆亮,陈建国,等.临床分离的革兰氏阴性菌 3类整合酶基因的筛查与 I类整合子结构分析[J].中国感染与化疗杂志,2009,9(1)：52-55.

[2] CLSI.Performance Standards for Anti—microbia1 Susceptibility Testing;Eleventh Informational Supplement[S].

[3] 张宏梅,石 磊,李 琳,等.沙门氏菌中第I类整合子的鉴定及特性分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(3)：214-2l7.

[4] 石 磊,竹田美文,山崎伸二,等.印度霍乱菌株整合子的解析[J].日本细菌学杂志,2002,57(2)：179.

[5] Yoko K,Susan G,Janet P,etal.The Two-component,ATP-dependent Clp Protease of E.coli[J].JBio Chemistry,1988,263(29)：15226-15236.

[6] 李 郁,焦新安,魏建忠,等.整合子与沙门菌多重耐药的关系[J].中国兽医杂志,2008,44(10)：92-93.

[7] Yang H C,Chen S,David GW,et al.Characterization of Multiple-antimicrobial Resistant Escherichia coli Isolates from Diseased Chickens and Swine in China[J].JClin Microbiol,2004,42(8)：3483-3489.

[8] Parveen S,Lukasik J,Scott TM,et al.Geographical Variation in Antibiotic Resistance Profiles of Escherichia coli Isolated from Swine,Poultry,Beef and Dairy Cattle Farm Water Retention Ponds in Florida[J].JAppl Microbiol,2006,100(1)：50-57.