利用RP－HPLC指纹图谱技术评价中草药添加剂的质量研究

付 媛，张雪娟，石团员，卢福庄

(浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021)

《中国药典》2010年版中收载有测定单味中药陈皮、黄芩、甘草等的HPLC方法［1］，但是同时测定复方制剂中甘草苷、橙皮苷、黄芩苷的方法尚未见报道。为更好的控制复中草药添加剂的质量，本研究采用高效液相色谱法对我室研制的防控猪高热综合征中草药添加剂进行分析，获得中草药添加剂的指纹图谱，并对其有效成分甘草苷、橙皮苷、黄芩苷进行定量研究，作为控制该产品质量的主要方法。

1 仪器与试剂

1．1 仪器 Agilent 1200液相色谱仪含紫外检测器，四元泵，柱温箱，自动进样器，层析柱为Agilent HC － C18色谱柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，预柱为Agilent HC－C18High performance Reliance Cartridge保护柱。DL－720A超声波清洗器为上海之信仪器有限公司产品。

1．2 药品与试剂 防控猪高热综合征中草药添加剂是由陈皮、黄芩、甘草等10多种中草药组成，由本研究室研发。黄芩，甘草，陈皮等组成中草药添加剂的药材均购自华东医药股份有限公司参茸药材分公司，为中药饮片，质量符合《中国药典》2010版要求。中草药饲料添加剂由10多种中草药各自预粉碎，过40目筛，再按处方比例混合而成。共购买单味药材2批次，1～9批次样品由第一次购买的药材制成，10～12批次样品由第二次购买的药材制成。对照品黄苓苷(批号:10121531，纯度大于98%)、橙皮苷(批号:10061831，纯度大于97%)、甘草苷(批号:10123131，纯度大于98%)均购自上海同田生物技术有限公司。乙腈为Scharlau公司产品，HPLC色谱纯。水为蒸馏水。其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2．1 分析条件 色谱柱:Agilent HC－C18色谱柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)和保护柱，柱温25 ℃，流动相由 A相和 B相 组成，A相为乙腈，B相为0．2%磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长280 nm，流速1 mL/min，进样量10μL。洗脱程序见表1，每次进样间隔时间10 min。

表1 流动相梯度洗脱程序

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品溶液的制备 分别取橙皮苷、黄苓苷、甘草苷对照品适量，精密称定，分别加适量甲醇溶解，制成400μg/mL的溶液。各取高浓度标准液用甲醇定量稀释成含橙皮苷20μg/mL、黄芩苷20 μg/mL、甘草苷40μg/mL的混合对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液的制备 取陈皮、黄芩、甘草药材和中草药添加剂粉末各0．1 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，超声提取15 min，用甲醇补足体积，浸泡12 h，摇匀，微孔滤膜(0．45 μm)滤过，即得。

2．3 方法学考察

2．3．1 对照品色谱测定 精密吸取混合对照品溶液(橙皮苷20μg/mL、黄芩苷20μg/mL、甘草苷40 μg/mL)10μL，进样测定，结果如图1所示。

图1 混合对照品RP－HPLC色谱图

2．3．2 精密度试验 取中草药添加剂0．1 g，精密称定，按2．2．2项下方法制备供试品溶液，重复进样6次结果表明，各主要色谱峰保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0．06% ～0．12% 和 1．00% ～2．23%，符合指纹图谱要求。

2．3．3 重复性实验 取同一批次的中草药添加剂样品0．1 g，分别同法制备样品6 份，按2．2．2 项下色谱条件测定，结果表明供试品溶液各主要色谱峰保留时间和峰面积均无明显变化，其RSD分别为0．03% ～0．09% 和1．82% ～2．27%，符合指纹图谱要求。

2．3．4 稳定性试验 取同一批中草药添加剂供试品溶液，分别在1、2、3、4、5、7 h 进样测定，结果表明各主要色谱峰保留时间和峰面积无明显变化，其RSD 分别在0．01% ～0．03%和0．71% ～1．58%之间，符合指纹图谱要求，表明供试品溶液在7 h内稳定性良好。

2．3．5 延迟时间色谱记录 以乙腈－0．2%磷酸溶液(95∶5)为流动相对中草药添加剂样品延长测试时间至2 h，记录色谱图，无滞后峰出现。

2．3．6 加样回收率试验 精密称取已知含量的中草药添加剂0．1 g，按供试品溶液制备项下操作，分别精密加入一定量的甘草苷、橙皮苷、黄芩苷对照品，重复操作6份，按上述方法测定含量，计算回收率。结果回收率分别为(99．56 ±3．33)%、(98．72 ±2．62)%、(103．53 ±2．27)%，RSD 分别为3．34%、2．66%、2．19%，表明方法的回收率良好。

2．4 中草药添加剂RP－HPLC指纹图谱建立及分析

黄芩、甘草、陈皮和12批次中草药添加剂0．1 g，按2．2．2项下方法制备供试品溶液，根据色谱分析结果，可分离出多个特征峰，从中选取15个稳定的特征峰(图2D)，12批次15个色谱峰的保留时间见表2。

表2 主要色谱峰的保留时间(n=12)

15个共有特征峰总面积占总峰面积90%以上，经与对照品的色谱图(图1)比较，根据保留时间定性确定3号峰为甘草苷，5号峰为橙皮苷，7号峰为黄芩苷。黄芩(图2A)、陈皮(图2B)、甘草(图2C)的色谱图分析可知:3号峰为甘草特有，5号峰为陈皮特有，1、4、6、7、9、11、13、14、15 号峰均为黄芩的特有峰，2号峰为陈皮和甘草共有峰，8号峰为黄芩和陈皮共有峰。10号峰为甘草和黄芩共有峰，12号峰为甘草、黄芩和陈皮共有峰，但这两个峰都以黄芩的成分为主。

图2 样品的RP－HPLC指纹图谱

2．5 中草药添加剂中橙皮苷、黄芩苷、甘草苷的含量测定

2．5．1 线性关系 取对照品橙皮苷、黄芩苷、甘草苷贮备液连续稀释，陈皮苷和黄芩苷浓度分别为400、200、100、50、25、12．5、6．25 μg/mL，甘草苷的浓度为 400、200、100、50、25、12．5、6．25、3．125、1．563、0．78125 μg/mL 的对照品溶液，进样量为10 μL，以进样量(x，μg)为横坐标，对橙皮苷、黄芩苷和甘草苷的峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，获得曲线方程见表3。

表3 对照品的回归方程(n＞7)

2．6．2 中草药添加剂中定量组分的含量测定 测定12个批次中草药添加剂中甘草苷、橙皮苷和黄芩苷特征峰的峰面积，计算中草药添加剂中甘草苷、橙皮苷和黄芩苷含量，结果见表4。

表4 样品中甘草苷、黄芩苷和陈皮苷的含量测定结果(n=12)

3 讨论和结论

防控猪高热综合征中草药添加剂是由陈皮、黄芩、甘草等10多种中草药组成，具有抗菌、抗病毒作用，由本研究室研发。在一些猪场应用的试验表明，添加剂可以显著提高猪瘟疫苗免疫后抗体的阳性率，推测中草药添加剂可能具有抵抗或消除上述病原对猪的免疫抑制作用，从而提高免疫的成功率，对猪高热综合征有较好的防控效果，并有提高增重和饲料转化效率、增强机体免疫力等多重作用［2－3］。

本研究根据文献报道［4－7］，在相同的条件下分别采用甘草苷的最大吸收波长276 nm，黄芩苷的最大吸收波长280 nm，橙皮苷的最大吸收波长284 nm对样品进行检测。结果在280 nm处可以同时检测到橙皮苷、黄芩苷、甘草苷，各成分均达到基线分离，并且基线平稳。故本研究选择280nm作为指纹图谱采集和有效成分定量分析的检测波长。

本研究采用了甲醇－0．2%磷酸溶液和乙腈－0．2%磷酸溶液两种流动相，以相同的梯度洗脱进行检测，发现在相同的积分条件下，采用甲醇－0．2%磷酸溶液系统，样品主要的色谱峰的保留时间在40 min以后，检测所需时间较长，且基线不稳定，噪声影响大。而采用目前的乙腈－0．2%磷酸梯度洗脱，分离效果好，主要色谱峰都出现在25～50 min，并且重现性强，基线稳定。所以流动相选择乙腈－0．2%磷酸溶液。

从获得的对照图谱可以看出中草药添加剂的特征峰主要出现在25～50 min内，主要的共有峰中黄芩的主要成分为多数，包括黄芩苷的9个峰。其中黄芩苷的峰面积占总峰面积的30%，提示中草药添加剂的甲醇制备供试品溶液的方法可以更有效的提纯出黄芩的主要成分。

本研究的重复性实验数据表明，本分析方法可靠，可以获得稳定的指纹图谱，可以作为防控猪高热综合征中草药添加剂的质量控制的有效方法。

［1］ 中国医药科技出版社，中国药典［S］．一部．2010:80，176，282．

［2］ 卢福庄，王志刚，付 媛，等．中草药添加剂对猪生产性能和猪瘟疫苗免疫效果的影响［J］．浙江农业学报，2011，23(1):56－ 61．

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［7］ 谢友良，曾惠芳，林 吉，等．HPLC测定黄芩正气胶囊中橙皮苷、黄芩苷和厚朴酚、厚朴酚的含量［J］．中成药，2006，28(1):34－36．