猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的研制

王贵华，王美君，汤 波，陈义峰，赵亚荣

(北京大北农动物医学研究中心，北京 100097)

断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post－weaning multi－systemic wasting syndrome，PMWS)主要是由猪圆环病毒2型(PCV－2)引起。猪圆环病毒有PCV－1和PCV－2两种基因型，PCV－1不具有致病性，但在正常血清中广泛存在。ORF1编码Rep蛋白，是引起PCV两个血清型之间抗原交叉反应的主要原因，因此只能用于鉴别PCV［1］。ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap蛋白)，具有很强的免疫原性，在两型之间不存在抗原交叉反应。因此Cap蛋白可作为PCV－2抗体检测的首选抗原［2－7］。本文通过表达的Cap蛋白，结合胶体金标记技术，建立PCV－2抗体胶体金检测试纸条，为养猪场开展PCV－2抗体监测提供简便方法。

1 材料与方法

1．1 材料 氯金酸、柠檬酸三钠试剂购自北京化学试剂公司;PCV－2抗原(Cap蛋白，为原核表达产物)、针对PCV－2Cap蛋白的PCV－2单抗由北京大北农动物医学研究中心制备保存;硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜、PVC板、吸水纸均购自上海捷宁生物科技有限公司;PCV－2抗体ELISA检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司;PCV－2、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)血清由本实验室保存，PCV －1、CSFV(猪瘟病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)、PPV(猪细小病毒)等阳性血清由中国兽医药品监察所提供。

1．2 PCV－2抗体检测试纸条的制备

1．2．1 胶体金的制备 用柠檬酸三钠还原法制备浓度为万分之四的胶体金溶液;

1．2．2 胶体金的标记 量取胶体金50mL，将胶体金调节pH值至9．0，搅拌并加入Cap蛋白1．2 mg，继续搅拌30 min，加入20%的PEG－2000终止反应，10000 r/min离心10 min，取沉淀，再用金标缓冲液溶至50 mL，备用。

1．2．3 冷冻干燥 将标记好的胶体金溶液均匀喷涂在玻璃纤维膜上，冷冻干燥后备用。

1．2．4 抗原抗体包被 把PCV－2抗原和PCV－2单抗分别包被在硝酸纤维素膜的检测线T和对照线C，干燥备用。

1．2．5 试纸的制备 把胶体金包被好的硝酸纤维素膜、吸水纸、加样区玻璃纤维素膜按顺序贴到PVC板上，切割成条，分装铝箔袋，袋内装入干燥剂，密封，常温保存。

1．3 样品检测及判定标准 将试纸条放在水平操作台上，取100μL血清滴加到样品孔，在室温下静置，15 min内观察结果。若在质控线出现红色条带而在检测线处不出现红线条带，说明样品为阴性;若在检测线和指控线处均出现红色条带，说明样品为阳性;若在质控线不出现红色条带，说明实验不成立，需重新取试纸条进行检测。判定标准见图1。

图1 试纸条判定标准

1．4 试纸条的评估

1．4．1 与 ELISA商品化试剂盒的符合率 用ELISA检测试剂盒和试纸条同时检测从猪场采集的38份疑似PCV－2血清，统计结果，并计算试纸条的符合率。

1．4．2 试纸条的敏感性 将标准阳性血清倍比稀释，观察试纸条的检测结果。

1．4．3 试纸条的特异性 用胶体金试纸条检测PCV －1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV 阳性血清，观察并统计结果。

2 结果

2．1 结果判定 在质控线和检测线处均出现红色条带，样品为阳性;在质控线出现红色条带而在检测线处不出现红色条带，样品为阴性;在质控线不出现红色条带，说明试验失败，需重新取试纸条检测;可疑样品需重新检测并与ELISA试剂盒作比较。结果见图2。

图2 试纸条结果判定

2．2 符合率 取38份猪血清，分别用检测试纸条和ELISA试剂盒(武汉科前)进行PCV－2抗体水平检测，符合率为94．7%，结果见表1。

表1 与ELISA商品化试剂盒对比结果

2．3 敏感性 将PCV－2阳性血清用PBS倍比稀释成1:2、1:4、1:8、1:16，再用 ELISA 试剂和试纸条进行PCV－2抗体水平测定，结果见表2。

表2 敏感性检测结果

2．4 特异性 通过对 PCV －1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV阳性血清进行检测。结果表明用试纸条检测猪血清中的 PCV－2抗体时，与 PCV－1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV等血清无明显的交叉反应，结果见表3。

表3 特异性检测结果

3 讨论

近年来，胶体金免疫层析技术广泛应用于激素或多种疾病相关蛋白的检测、病原的抗原抗体检测、药物浓度的检测、食品和环境中相关物质的检测等方面［8－12］。本研究用胶体金标记技术，将胶体金标记PCV－2Cap蛋白，结合单克隆抗体又有良好的特异性和敏感性，建立了一种快速检测PCV－2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时，样品中的PCV－2抗体同胶体金标记的金标抗原结合物反应，形成复合物并沿层析条向前移行，液体移行至检测线包被区时，与预包被的PCV－2抗原形成抗原抗体复合物而凝聚显色。游离胶体金标记的PCV－2抗原则在对照线处与PCV－2单抗结合而富集显色;对于阴性样本，由于没有PCV－2抗体存在，在检测线区将不会出现抗原抗体复合物而显色，仅在对照线处显色。

试纸条采用的抗原PCV－2Cap蛋白是大肠杆菌表达的可溶性蛋白经纯化后的产物。通过基因工程方法可以生产大量廉价的生物活性蛋白。对照线处包被的针对PCV－2Cap蛋白的单克隆抗体，具有良好的特异性和敏感性，保证了实验的有效性，而且单克隆抗体也可以用体外培养法大量生产，这就大大降低了试纸条的生产成本。

猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸条，不需要实验室和仪器设备，只要将待测血清加入加样孔内，平放，室温静置15 min，即可观察检测结果。本试纸条与ELISA方法相比，快速、简便、成本低、可操作性强，很适合基层养猪场进行抗体的实时监测，给养猪生产提供便利条件。

［1］ 魏 巍，杨汉春，郭 鑫，等．猪圆环病毒2型ORF2重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定［J］．中国兽医杂志，2007，11(43):9－11．

［2］ Lou Z，Li X，Li Z，et al．Expression and antigenicity characterization for truncated capsid protein of porcine circovirus type 2［J］．Can JVet Res，2011，75(1):61．

［3］ Marcekova Z，Psikal I，Kosinova E，et al．Heterologous expression of full－length capsid protein of porcine circovirus2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies［J］．J Virol Methods，2009，162(1):133．

［4］ Mahe D，Blanchard P，Truong C，et al．Differential recognition of ORF2 protein f rom type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes［J］．J Gen Virol，2000，81(7):1815－1824．

［5］ Chae C．A review of porcine circovirus 2－associated syndromes and diseases［J］．Vet J，2005，169(3):326 －336．

［6］ Patterson A R，Johnson J，Ramamoorthy S，et al．Comparison of three enzyme－linked immunosorbentassays to detect Porcine circovirus－2(PCV－2)－specific antibodies after vaccination or inoculation of pigswith distinct PCV －1 or PCV －2 isolates［J］．JVet Diagn Invest．2008，20(6):744．

［7］ Lefebvre D J，Costers S，Van Doorsselaere J，et al．Antigenic differences among porcine circovirus type 2 strains，as demonstrated by the use ofmonoclonal antibodies［J］．JGen Virol，2008，89(1):177．

［8］ 陈凤梅，李 娟，曲原君，等．免疫胶体金技术的应用及研究进展［J］．中国兽药杂志，2004，38(8):33－35．

［9］ 张 明，吴国娟，沈 红，等．免疫胶体金法检测磺胺甲嗯唑残留的研究［J］．中国兽药杂志，2006，40(4):17－19．

［10］金颜辉，黄印尧，张长弓，等．猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸的研制［J］．福建畜牧兽医，2007，1(29):5－6．

［11］王慧杰，乔宏兴．胶体金免疫层析法检测猪圆环病毒2型Cap抗体方法的建立及应用［J］．中国兽医杂志，2007，8(43):23－25．

［12］范晓娟，李 刚，史利军，等．检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立［J］．中国畜牧兽医，2009，7(36):158－160．