鸭疫里氏杆菌病诊断方法研究进展

么乃全，高云航，徐凤宇，张 敏，王全凯

(1．吉林农业大学动物科技学院，长春 130118;2．中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸭疫里氏杆菌病俗称雏鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起1～8周龄雏鸭的一种急性或慢性传染病，可导致2～3周龄雏鸭大批发病、死亡，生长发育严重受阻。在世界各养鸭地区几乎都有流行，已成为影响养鸭业最为严重的细菌性传染病。该病也可发生于其它禽类如鹅、火鸡等，从鸡、雉、鹌鹑、鸽子及野生水禽也分到该菌［1］。Bocklisch等还证实了该菌可导致鸵鸟死亡，并从其体内分离到 RA［2］。感染 RA病鸭主要临床表现为精神萎靡、食欲下降、歪颈、跛行、眼鼻流出浆液性或粘液性分泌物，腹泻，粪便呈黄绿色，病鸭出现痉挛、角弓反张等神经症状。病理变化主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎等。在临床上常与大肠杆菌混合感染，且与大肠杆菌和沙门菌的剖检变化非常相似，因此确诊需进行实验室诊断。目前RA的诊断方法主要包括常规的细菌分离鉴定、免疫血清学技术及各种PCR方法等。本文将对其研究进展进行简要概述。

1 细菌分离鉴定

病料可采集发病鸭的脑、肝脏及心血，接种于含5%～10%犊牛或兔血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)或马丁琼脂平板、巧克力琼脂平板，置于5%～10%的CO2培养箱或蜡烛缸中，37℃培养12～24 h，菌落形态为圆形光滑、边缘整齐、半透明，直径约1 mm，在TSA培养基上为露滴样稍带绿色荧光。对疑似菌落进行染色，镜检可见革兰染色阴性、散在的短杆菌，少数呈短链状排列，美兰染色则呈两极浓染。该菌的生化特性不活泼，仅发酵少数糖类，利用其不发酵葡萄糖和乳糖的特点，可与巴氏杆菌相鉴别。若与大肠杆菌与沙门菌相鉴别，可将采集的病料或疑似菌落接种于麦康凯琼脂平板，RA不生长，大肠杆菌形成红色菌落，而沙门菌则形成无色菌落。

2 免疫学检测技术

2．1 琼脂扩散试验 将纯培养的疑似RA经水浴煮沸1 h，4000 r/min离心30 min，取上清液作为待检抗原，将其与标准阳性血清反应，出现沉淀线即为阳性反应。也可用已经鉴定的RA制备抗原检测血清中的特异性抗体，但由于鸭疫里氏杆菌的血清型较多，各血清型间很少存在交叉反应，要采用该方法进行检测需有多种血清型的阳性血清。目前，该方法主要用于RA血清型的鉴定，需注意的是琼脂扩散试验敏感性稍低，检测不出凝集价低于1∶20的血清样品，若抗体效价过低，同型的抗原抗体反应较弱易造成假阴性结果［3］。

2．2 凝集试验 凝集试验分为玻片凝集试验和试管凝集试验两种。用阳性血清通过玻片和试管凝集试验可以对同型细菌进行快速鉴定，并能掌握所检测病原菌的血清型。其中玻片凝集容易出现交叉反应，适用于大量菌株快速筛选，要准确定型还须依赖于试管凝集试验［4］。试管凝集试验可更准确的进行血清型鉴定、血清流行病学调查以及抗体效价检测。虽然也易检测到交叉反应，但可以通过参照菌及凝集效价的高低来定型。当分离株与参考株的效价相差3个或以上滴度时，可判断为异型或至少可肯定它们存在抗原差异;若分离株与参考菌的效价相等或相差1个滴度时，一般可认为是同型，但也不能排除存在抗原差异的可能［3］。

2．3 间接免疫酶组织化学法 刘维平、孟琼华等［5－6］先后用血清1型RA作为抗原，免疫兔制备兔抗RA的IgG，建立了检测雏鸭和雏鹅感染鸭疫里氏杆菌的间接免疫酶组织化学法(Indirect Immuno Histo Chemical Technique)，可用于现场鸭疫里氏杆菌病的快速诊断，通过优化各反应条件使该方法检测临床可疑病例的敏感性高于细菌分离鉴定，该方法还可对抗原进行精确定位，适用于鸭疫里氏杆菌病致病机制的研究。免疫组织酶法相比于免疫荧光技术最大的优点是其不需要荧光显微镜。基层单位可将制作的标本片长期保存，只需光学显微镜即可观察。

2．4 免疫酶检测技术 目前，国内外已报道多种检测RA抗体的ELISA方法。RA全菌体、菌体裂解物和脂多糖等均被用作包被抗原建立间接ELSIA方法，具有较好的特异性和敏感性，但只限于同种血清型菌株抗体的检测，应用有很大的局限性。外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OmpA)是RA菌体主要的表面抗原，能够刺激机体产生抗体，已经广泛被用做检测RA抗体的抗原。孙龚、程龙飞等［7－8］分别以血清1型和2型RA的OmpA重组蛋白建立了间接ELSIA检测方法，并应用于同型血清抗体的检测。同时众多研究还证明OmpA为各血清型菌株所共有，且经免疫印迹证明能够与各血清型菌株抗体均发生反应，足以说明该蛋白可用于多种血清型抗体的检测。但目前尚未见到以OmpA蛋白为抗原建立ELSIA方法检测多血清型抗体的研究报道。其实际应用效果还有待于进一步验证。Huang等［9］以一种可能为新的RA表面抗原P45编码的41 kDa重组蛋白rP45N’为抗原建立了ELISA方法，可成功检测到血清型 1、10、15、9和 ATCC 11845菌株免疫鸭的P45抗体。同时还发现编码p45的DNA序列除了血清型10外的1～19型中均存在。辜新贵［10］则从鸭疫里氏杆菌1型基因组文库中筛选出一种“保守假定蛋白P25”，序列分析表明 P25 是 RA1、2、5、8、10 血清型所共有的抗原蛋白，并利用P25表达蛋白为抗原建立了敏感性高和重复性好的间接ELISA检测方法，能特异性检测出RA1、2、5、8、10 血清型的感染。以上研究表明 P45和P25蛋白可作为抗原检测各种血清型RA抗体。

方钦［11］通过原核重组表达及亲和纯化的协同溶血素CAM融合蛋白，建立了间接ELISA方法。经验证该方法能检测感染鸭血清中抗体，而检测灭活苗免疫鸭血清抗体为阴性。说明以CAM融合蛋白为抗原建立的ELISA检测方法能够区分自然感染和灭活疫苗免疫，可用于RA感染诊断及流行病学调查。

2．5 免疫亲和传感器检测技术 免疫亲和传感器检测技术是生物传感器检测技术的一种，是指固定有抗原或抗体生物组件与待测物(抗体或抗原)发生亲和性结合时，造成生物分子形状改变或引起诸如电荷、厚度、质量、热量或光学等物理量的变化。这些变化经物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可检出待测物中抗原或抗体的浓度［12］。Chenghong Huang等［13］将抗鸭疫里氏杆菌的卵黄抗体IgY固定于改良的化学物质表面作为传感层，通过椭偏光学生物传感器(Biosensor based on imaging ellipsometry，BIE)对传感层捕获的RA抗原进行定量检测，可以检测至少5．2×103CFU/mL的RA。同时还发现该技术能够区分1、2、4、14等几种血清型的RA菌株。该方法具有快速、简单、高灵敏度和低成本的优点，与其他方法相比具有不可比拟的优势，可用于RA病原的检测及血清型的鉴定。

3 PCR检测技术

3．1 普通PCR检测 曲丰发等［14］针对16S rDNA基因设计一对特异性引物，分别以基因组DNA和菌落提取液为模板对1～19型RA参考菌株及26个国内分离株进行扩增，均可扩增出654 bp大小的片段。而大肠杆菌、鸭沙门菌和多杀性巴氏杆菌扩增结果为阴性，基因组DNA最小检出量为50 pg，说明所建立的方法具有较高的特异性和敏感性。孙䶮等［15］则根据已发表的鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白A的基因序列设计1对引物，对7株不同血清型鸭疫里氏杆菌进行扩增，均扩增出与预计大小一致的目的片段，敏感性可达到8．6 pg，而多杀性巴氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌和金色葡萄球菌均未扩增出预计大小的片段。Kardos等［16］根据一段700 bp大小的肠道细菌基因间重复序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)设计引物建立了能够特异性检测RA的ERIC－PCR方法，临床分离的72株RA的检测结果与生化鉴定结果相一致，而对支原体、巴氏杆菌、沙门菌等检测结果为阴性，可用于RA的快速鉴定。PCR检测方法特异性高、敏感性强，可以避免血清型的限制，能够实现对RA的快速检测。

3．2 多重PCR检测 谭宗华［17］等对鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析，根据二者16S rRNA相同保守区设计1条公用引物，根据各自可变区设计了2条种特异性引物，建立了能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法。分别从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718 bp的DNA片段。该方法能从肝组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段，缩短了检测时间。王春平［18］根据鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的外膜蛋白A基因序列设计2对引物，建立了快速检测2种疾病的多重PCR检测方法。该法能直接以肝脏组织研磨后的滤液为模板分别扩增出670、408 bp的特异性DNA片段，与常规PCR检测方法的符合率达100%，且省去了细菌纯培养和基因组提取等步骤，所需时间短，能达到快速诊断并鉴别两种疾病的目的。Qinghai Hu根据RA的DnaB螺旋酶、大肠杆菌的碱性磷酸酶和沙门菌的侵袭蛋白基因作为目的基因建立了能同时检测并区分三种细菌感染的多重PCR方法［19］，检测限可达103CFU。其中RA的DnaB螺旋酶首次被用于检测，序列分析表明该基因在RA不同血清型间同源性达98．1% ～100%，表明该方法可用于各种血清型RA的检测。多重PCR方法在具备普通PCR敏感性和特异性的基础上可以实现同时对多种病原进行检测，提高了检测效率。

3．3 荧光定量 PCR检测 冯金牛［20］等根据 RA 16S rRNA基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该方法只对RA DNA有阳性扩增信号，对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门菌均无特异性反应，具有高度特异性，敏感性比普通PCR高100倍。谢永平［21］等根据RA的外膜蛋白A基因保守序列设计引物和探针，建立了实时荧光定量PCR方法，对煮沸法提取人工感染鸭组织RA基因组进行检测，阳性检出率为92%，比RA分离率高84%。同时利用该方法可快速检测活鸭咽喉拭子和泄殖腔拭子，不需通过剖杀活鸭采集脏器检测，为RA流行病学调查、感染早期诊断、种鸭引进的隔离检疫、市场检疫、进出口检验检疫等提供了新的快速检测途径。荧光定量PCR不需电泳、染色等操作，省时且避免了环境的污染，还能对病原进行定量分析，对进一步研究RA致病机制具有重要意义。

3．4 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增法(LAMP)是 Notomi［22］开发的一种新的核酸扩增技术，针对小于300bp基因序列设计4种特异性引物，利用BST DNA聚合酶在水浴加热恒温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列，不需PCR仪等设备，检测结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成即可判断。Fuying Zheng等［23］建立了检测RA的LAMP方法。根据RA外膜蛋白A 60～239 bp之间的基因序列设计了6条引物，该法成功地从参考菌株、分离菌株及感染鸭脑检测出该基因，敏感性比普通PCR高出10倍。陈红梅［24］于2010年根据RA外膜蛋白A基因序列中300 bp的片段为模板设计了一套引物，也成功建立了环状等温介导PCR法。通过条件优化，显示了很高的特异性，DNA模板的灵敏度可达800 fg。杨金龙［25］根据鸭疫里氏杆菌16S rRNA保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，开发出鸭疫里默氏杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，可以特异地区分鸭疫里氏杆菌与大肠杆菌及沙门菌，具有高度特异性，已申请国家专利。该方法对引物设计要求较高，采用荧光染料判定结果时易出现开盖污染的问题，但操作简单，对实验条件要求不高，非常适合基层RA的诊断。

随着各种新技术的应用，鸭疫里氏杆菌病诊断方法也不断被开发。PCR诊断方法不仅具有很高的特异性和敏感性，且方便、快捷，还能摆脱RA不同血清型的限制，将在鸭疫里氏杆菌病诊断中发挥越来越重要的作用。常规血清学检测方法除了能用于疾病检测外还可以用于疫苗质量评价及指导制定免疫程序。OmpA、P45及P25等蛋白的应用已经在一定程度上解决了RA血清型间交叉反应小的问题，且随着对RA免疫和致病机制的深入研究，相信会有更多具有交叉反应性或保护性的蛋白被开发，从而为鸭疫里氏杆菌病的诊断和免疫防控提供新的方法和思路。

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