猪乙型脑炎疫苗的研究进展

秦红刚，肖 敏，李 伟，谢红玲，漆世华，温文生，吴玉石

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

乙型脑炎又称日本脑炎(Japenese Epcephalitis B)是一种嗜神经性虫媒病毒乙型脑炎病毒(Japenese Epcephalitis Virus，JEV)引起的人兽共患传染病，引起人类的脑炎，对猪的致死率不高，但能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，公猪发生睾丸炎［1］。乙型脑炎病毒通常在蚊－猪－蚊等动物间循环，猪是乙型脑炎病毒最重要的自然增殖动物，是主要的传染源。因此对猪乙型脑炎的防控具有重要的公共卫生学意义。疫苗的免疫接种是目前防控猪乙型脑炎的重要手段，本文就猪乙型脑炎疫苗的研究现状做一个简要的综述。

1 常规疫苗

临床上常用的猪乙型脑炎疫苗有鼠脑灭活苗和减毒活疫苗两种，现分别简述如下:

1．1 灭活疫苗 鼠脑灭活疫苗于上世纪50年代在日本研究成功，是当前惟一获得世界卫生组织批准并用于商品化出售的人用乙型脑炎疫苗。目前鼠脑灭活苗已经准许在中国、日本、印度、朝鲜、韩国、泰国等地生产和使用，其中美国、加拿大等国家使用的是日本BIKEN公司生产商品名为JEVAX［2］。泰国、印度、越南、朝鲜和马来西亚等乙型脑炎高度流行的国家使用该疫苗后，有效的降低了乙型脑炎的感染率［3］。鼠脑灭活疫苗免疫效果确实，且安全可靠。

我国最早研制成功的猪乙型脑炎疫苗即为鼠脑灭活疫苗，1996年获得新兽药注册证书，研制单位是湖北省农科院畜牧兽医研究所。该单位从流产胎猪脑内分离出的一株猪乙型脑炎强毒WH－1株，脑内接种7～9 g的小鼠，收获发病小鼠的脑组织，过滤、灭活、乳化等工艺制成疫苗。该疫苗对各类猪群，尤其是对青年妊娠母猪和公猪的安全性好，免疫接种后无异常反应，无病毒血症及胎内感染，对猪乙型脑炎引起母猪繁殖障碍保护率高［4］。

1．2 减毒活疫苗 猪乙型脑炎减毒活疫苗是湖北省农科院畜牧兽医研究所研制。生产毒株SA14－14－2由中国药品生物制品检定所采用分离自蚊幼虫的SA14株乙型脑炎病毒进行传代、噬斑筛选得到［5］。用该毒株接种地鼠肾原代细胞培养，收获病毒培养液，加适宜的稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。该减毒活疫苗具有可靠的安全性、良好的免疫原性。用后备母猪进行免疫原性试验，能产生良好的免疫应答;免疫该疫苗的初产母猪能抵抗JEV强毒的攻击，不产生病毒血症，对胎儿感染的保护率达100%［6］。该疫苗的质量标准已经收录入2010版《中国兽药典》。但由于地鼠肾原代细胞基质无法获得WHO的认证，此种疫苗尚未在国际上使用。

2 新型疫苗

尽管上述两种常规疫苗在猪乙型脑炎的防控中发挥了重要作用，但鼠脑灭活疫苗生产成本相对较高，减毒活疫苗本身存在毒力返强的危险，人们有必要开发新型猪乙型脑炎疫苗。

2．1 重组活载体疫苗 乙型脑炎病毒和猪瘟病毒属于黄病毒科的成员，其基因结构具有一定的同源性，因此可以通过反向遗传学技术将其中一种病毒结构蛋白的基因替换另一种病毒的结构基于构建嵌合病毒。Yang Z等［7］将截短的JEV E基因代替猪瘟病毒的E基因，构建了反向互补的乙型脑炎－猪瘟嵌合复制子病毒颗粒(CSF－JE virus replicon particle，CSF－JE VRP)。用 CSF－JE VRP免疫小鼠后能够诱导乙型脑炎特异性抗体，并能抵抗JEV强毒的攻击;免疫猪后能够同时诱导强烈的抗乙型脑炎和猪瘟病毒的抗体，为开展猪乙型脑炎猪瘟二联基因工程疫苗的研究奠定了基础。

赛诺菲巴斯德公司以黄病毒17D株为载体，用乙型脑炎病毒SA14－14－2株prM和E基因代替黄病毒17D的prM和E基因，构建成功了黄热乙型脑炎嵌合病毒。三期临床证明，其安全性与接种安慰剂组相当，而优于鼠脑灭活疫苗，一次单剂量接种血清抗体转阳率为99．1%［8］。该疫苗已经在澳大利亚注册成功［9］。此外，还有用痘病毒和伪狂犬病毒作为载体的，但均处于实验室研究阶段。

2．2 亚单位疫苗 JEV E基因具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗研究的首选靶蛋白。Xu XG等［10］构建重组杆状病毒表达JEV E蛋白，用表达的蛋白免疫小鼠和猪，可以诱导JE特异性中和抗体，保护小鼠和猪免受JEV的攻击。

乙型脑炎病毒样颗粒疫苗在生产过程中可避免乙型脑炎病毒的操作，避免了生物安全隐患，又具有良好的免疫原性，是一种较理想的疫苗形式。JEV结构蛋白(prM/M和E)在载体病毒感染或由表达M、E蛋白的真核表达载体转染的细胞培养物中可以自身装配成病毒样颗粒。Kojima等［11］构建了基于Beijing－1毒株的prM－E蛋白编码基因的真核表达载体，筛选稳定表达E蛋白的细胞克隆，将表达的E蛋白免疫小鼠，7个月后仍保持高滴度的中和抗体，用JEV强毒对小鼠进行攻击后，保护率为100%，使得病毒样颗粒成为乙型脑炎疫苗研究的重要思路。

2．3 DNA疫苗 DNA疫苗是将抗原基因重组到真核表达载体，注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答。Konishi E构建了两株基于prM和E基因的DNA疫苗，以100～450μg剂量间隔3周对猪进行二次免疫。二疫后第1周即产生1∶40～1∶160的中和抗体和血凝抑制抗体，而且高水平的血凝抑制抗体能够维持 245 d［12］。Zhang Y 等［13］又发现对E蛋白的N154糖基化位点进行突变后，能够增强该DNA疫苗对小鼠诱导的体液免疫反应。

3 猪乙型脑炎疫苗的发展方向

3．1 开展组织细胞培养猪乙型脑炎疫苗的研究

鼠脑灭活苗是由鼠脑组织制备的，疫苗的生产必须经过每只小鼠的脑内接种，感染鼠脑的收获，操作过程繁琐，难以形成工业化生产规模。随着地鼠肾细胞苗的诞生，标志乙型脑炎疫苗由组织苗向细胞苗发展，SA14－14－2株活疫苗生产工艺简单，成本低廉，但是原代地鼠肾细胞难以杜绝外源因子的污染。为此，人们又采用传代细胞Vero细胞为基质制备疫苗，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性，而且研究表明，乙型脑炎病毒对Vero细胞比较敏感，不需要传代适应，P3株10代以内免疫原性不会降低［14］。目前Vero细胞人用乙型脑炎灭活苗已经在美国、加拿大、以色列、中国等多个国家注册使用［15］。可以说人用乙型脑炎疫苗的发展经历了动物组织苗、原代细胞苗和传代细胞苗的发展历程。猪乙型脑炎疫苗的生产还处于组织苗和原代细胞苗的阶段。随着猪乙型脑炎防控的需要，猪乙型脑炎组织细胞培养疫苗的研究也会越来越被人们所重视。目前我公司在现有的鼠脑灭活苗的基础上，正积极开展猪乙型脑炎Vero细胞灭活疫苗的研究，期望在不久的将来为我国猪乙型脑炎的防控提供一种新型疫苗。

3．2 开展猪乙型脑炎基因工程疫苗的研究 基因工程疫苗是当前分子生物学、分子免疫学发展的产物，包括DNA疫苗、重组活载体疫苗、基因工程亚单位疫苗等，是兽用疫苗发展的一个重要方向。目前已有数个产品在田间应用，如禽流感－新城疫重组二联活疫苗(rL－H5株)［16］;鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗(vHVT－013－69株)［17］等。在猪乙型脑炎疫苗的研究方面，尽管人们在重组活载体疫苗［7］、DNA 疫苗［12－13］等方面做了很多的基础性的工作，但均处于实验室研究阶段，应用到临床还有大量的工作要做。随着对猪乙型脑炎致病机制研究的深入，研制猪乙型脑炎基因工程疫苗将成为预防猪乙型脑炎重要的发展方向。

3．3 开展猪乙型脑炎疫苗新生产工艺研究 疫苗的生产工艺是决定疫苗安全性、质量稳定性的关键因素。乙型脑炎疫苗的发展也伴随着生产技术的提升，也是疫苗有效性、安全性、稳定性不断提升的过程。鼠脑灭活苗产量有限，疫苗的生产属于纯手工操作，工业化生产受到限制。而Vero细胞作为传代细胞，适合于大规模高密度培养。Keishin Sugawara等采用生物反应器微载体悬浮培养技术，建立了500L的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗生产体系［18］，真正实现了生产的工业化自动化控制。可以预见的是生物反应器微载体生产工艺将会逐渐成为主流生产工艺，替代手工操作的生产工艺。

粗制疫苗含有异源蛋白和亚细胞成分，免疫后会引起副反应，而浓缩纯化抗原可以提高疫苗免疫效果、降低副反应。为此，人用乙型脑炎疫苗采用了抗原的超滤浓缩纯化工艺，并将牛血清白蛋白残留量、宿主细胞DNA和蛋白质残留量纳入质量标准［19］。目前猪乙型脑炎疫苗均为粗制疫苗，纯化工艺还没有被应用。但随着养殖业的发展，高品质纯化疫苗会有更多市场需求，纯化工艺研究和应用会越来越来普遍。

4 结语

尽管猪乙型脑炎疫苗的研究已经取得一定的进展，但目前用于临床的还是鼠脑灭活疫苗和减毒活疫苗两种传统疫苗。相信随着对猪乙型脑炎研究的深入，人们终将研究出更为安全、有效、经济、实用的猪乙型脑炎疫苗。

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