细胞因子在疫苗中的免疫增强作用

罗满林,唐明森,鲁俊鹏

(1.广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴 527400；2.广东温氏食品集团研究院,广东新兴 527400；3.华南农业大学兽医学院,广州 510642)

细胞因子(cytokine)是一类由活化的免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)和相关细胞(纤维细胞、内皮细胞等)产生的具有调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子或糖蛋白,能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能,它们通过与高亲和力的特异性受体相互作用,在低浓度下发挥作用,是机体发挥免疫功能不可缺少的成分[1]。在动物体内,绝大多数细胞因子含量很低,其作用主要是提高动物的免疫功能及与动物的生长和代谢有关。主要包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)等。细胞因子通过旁分泌或自分泌方式发挥生物学作用,它有特定的靶细胞,并通过靶细胞膜上的特异性受体发挥作用。细胞因子具有免疫调节、抑制肿瘤增殖、促进造血与组织修补和参与炎症反应以及神经内分泌效应等多种生物学功能[2]。随着分子生物学技术的迅速发展,对细胞因子研究的不断深入,更多的细胞因子为人们所认识,其应用也越来越广泛。多种细胞因子已被用于作用体内免疫活性细胞,促进机体产生免疫应答,作为佐剂来增强基因疫苗的免疫效果。本文叙述了细胞因子在免疫增强剂和免疫治疗剂、构建新型基因工程苗等方面的主要研究进展。

1 干扰素

干扰素是一类具抗病毒、抗肿瘤、影响细胞生长、分化和调节免疫功能等活性的蛋白,分为三类：IFN-α、IFN-β、IFN-γ。其中 IFN-α、IFN-β具有相似的生物学活性,统称为Ⅰ型干扰素,IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,其生物学活性与Ⅰ型干扰素有明显的不同,能诱导 Th0细胞分化成 Th1细胞,可增加抗原递呈细胞的主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)分子的表达,对产生 CTL应答和提高 IgG抗体有很大帮助。干扰素是当代生物技术药品中基础和临床研究最为广泛的生物激活素。

Babiuk等应用 rbIFN-α(重组牛干扰素)来防治牛呼吸道疾病,在用牛疱疹病毒攻毒前 2天,犊牛鼻内给药 rbIFN-α,发现给药的犊牛呼吸道综合征显著少于对照犊牛。同样,接种溶血性巴氏杆菌4 d后,再注射 rbIFN-α,可以明显缩短发病期和减缓肺炎症状。IFN-α能直接抑制病毒复制,激活NK细胞,增强 CTL识别病毒感染细胞的能力及调节 MHC分子表达[3]。同年,Peel等的实验表明大剂量鼠伤寒沙门氏菌感染犊牛,同时肌注 rbIFN-γ,可以提高感染犊牛的存活率。Reddy等给母牛注射 rbIFN-γ,和对照组相比,对疱疹性口炎病毒具有较强的免疫保护作用。在牛的哺乳期内,适量注射 rbIFN-γ或IL-2可以提高淋巴细胞的杀菌能力,预防细菌性乳房炎。IL-12或 IFN-γ与HBV DNA疫苗联合免疫小鼠,明显增强了 TH1型免疫应答,提高了抗 HBV的表面 IgG2a抗体的产生,但 TH2型免疫应答和 IgG1抗体的产生受到明显的抑制,CTL活性明显提高[4]。Sordillio和Babink证实了大肠杆菌性乳腺炎可以被 rbIFN控制。1987年,Pjagfair等首先发现 rbIFN-γ具有佐剂的效果,其作为免疫佐剂在疟疾疫苗和水泡性口炎疫苗中有良好的效果。1999年,Plachy等进行鸡重组干扰素(rChIFN)防治劳氏肉瘤病毒(RSV)肿瘤的研究,获得了抗病毒的显著效果。有人发现rChIFN-γ可以作为抗球虫制剂和免疫增强剂[5]。目前,已经确定 rChIFN-γ作为疫苗佐剂对鸭病毒性肝炎等鸭病进行防治,可以明显提高其效果。

贾立军等[6]提出利用共表达 γ干扰素和新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因的重组鸡痘病毒 rFPV-NDV免疫 17日胚龄火鸡胚,在 NDV强毒株攻击后,保护率显著高于 rFPV-NDV单独免疫,表明 γ干扰素具有免疫增强作用。彭大新等[7]利用适当剂量组合的表达马立克氏病病毒 gB基因的重组鸡痘病毒(rPPV-MDV-gB)和 rPPV-INF-γ联合免疫 SPF鸡,保护指数也高于 rPPV-MDV-gB单独免疫。

马凤龙[8]实验证明了不同剂量的猪重组 γ干扰素分别与猪瘟兔化弱毒苗、猪蓝耳病弱毒苗和伪狂犬弱毒疫苗联合应用,可提高血清抗体水平,增强疫苗的免疫效果。与此相反,Xiang等报道了在DNA疫苗中共免疫 IFN-γ的效应,在狂犬病病毒感染的鼠模型中,共表达 IFN-γ出现了对疫苗免疫原性轻微的负效应,主要表现为抑制辅助性细胞增殖反应和降低狂犬病病毒特异性的中和抗体水平。Leong等以共表达 IFN-γ和流感病毒血凝素的重组鸡痘病毒免疫鼠时发现,γ干扰素虽不影响细胞介导的免疫反应,但会显著抑制针对 HA的抗体。孙永科在用鸡传染性支气管炎(IB)弱毒苗与 rFPV-IFN-γ联合免疫,以及用共表达 IBVS1和鸡 IFN-γ的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ-S1)免疫鸡时也发现这两组鸡的抗体水平均低于IB弱毒苗单独免疫组。但胡慧琼研究证实,菌苗接种前注射 γ干扰素,抑制特异性抗体的产生,而接种后使用则可逆转对抗体的抑制作用。我们推测造成这种差异的原因之一可能是疫苗免疫时,应用 IFN-γ的时间不同和干扰素或疫苗的差异造成的。其具体机制还有待于进一步研究。

2 白细胞介素

白介素是由各种白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子,在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。至今得到公认的白介素有 18个,分别命名为 IL-1～IL-18。其中,IL-3又称多能集落刺激因子,可刺激多能造血干细胞和各系祖先细胞的分化和增殖,表现为对淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等的分化和成熟皆有一定促进作用。

在基因工程疫苗研制中,常把细胞因子基因(例如,IL-2、IL-1、GM-CSF等 )和保护抗原基因连接在一起,构成融合蛋白,以增强疫苗的抗体产生和细胞免疫水平。IL-2在体内的半衰期也因此而延长约四倍。采用此种方式获得 IL-2抗原重组蛋白,是研制新一代基因工程疫苗的一种有效途径。仅以氢氧化铝为佐剂的传统方法,对含IL-2的重组糖蛋白不能起到保护作用[9]。

Nanberg等报道,以 IL-2和狂犬病灭活苗联合应用,攻毒后,疫苗对试验鼠的保护作用至少提高 25倍。Reddy等报道,将低剂量(2.5～0.25 IU/kg)重组牛 IL-2与牛疱疹病毒 I型活苗(BHV21)联合使用[10],血清中和抗体滴度比单独使用疫苗组提高 6倍,攻毒后病毒排毒减少 4倍。

李震等[11]分别利用巴马小型猪和杜长上杂交肉猪(断奶初期)进行了猪蓝耳病弱毒疫苗和 IL-2接种牛的试验,证明 rb IL-2可有效促进试验猪血液中蓝耳病毒中和抗体水平的提高,一致表现在促进初免的抗体水平迅速上升,疫苗剂量相对较低时,促进二免中和抗体水平的上升。

Grakoui A等发现将包含 HCV-C蛋白的基因片段插入真核表达载体 pcDNA3.1中,构建重组质粒 pcDNAHCV-C。将此重组质粒单独或与包含鼠IL-2或 IL-12基因的表达质粒共免疫 BALB/c小鼠,可增强基因疫苗诱导的免疫应答强度,可能有利于机体优先诱导 CTL免疫应答,清除病原体。Weinberg等发现 IL-2可提高单纯疱疹病毒粗提物或其糖蛋白亚单位苗的免疫效果[12]。Ram等[13-15]先后报道将小鼠或人 IL-2 cDNA与含禽流感病毒血凝素(HA)基因的痘病毒重组,获得可以表达 IL-2的重组病毒,将这种重组病毒与不含IL-2基因的痘病毒同时接种裸鼠,结果显示,IL-2的插入并不影响 HA的表达水平及免疫原性,但可以防止对裸鼠的致死性攻击,说明插入细胞因子可以大大提高活病毒载体的安全性[16]。此后,又将 IFN等基因插入痘病毒,也取得了同样的结果。Hazama等将 IL-2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白 K基因融合,真核细胞内表达融合蛋白,免疫小鼠后攻毒,结果该融合蛋白可以完全保护小鼠免受病毒的攻击。Yanira等发现重组鸡痘病毒(rFPV)表达的 IL-1β和 IL-2在一定的剂量下可以增强La Sota疫苗的免疫效果,具有免疫增强作用[17]。Schijns等报道了重组 TNF-α、IL-1α、IL-2和IFN-γ对狂犬病灭活苗的增强效果[18]。表明重组IL-2和 IFN-γ的作用相当,可使疫苗达到 50%保护的稀释倍数提高 50倍。当标准疫苗做1∶10 000稀释时,仍可提高保护性免疫。

另外,魏晓丽等[19]报道 IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子接种孢球蚴后水平均上升,而IL-4、IL-10等 Th2型细胞因子相对维持较低水平,这表明细胞因子在宿主对孢球蚴的免疫应答中可能起重要作用。据此,杨梅等[20]将重组 Bb2EmⅡ/32Em142323疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜接种和口服接种法免疫 BALB/c小鼠12周后,用 50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后 18周剖杀小鼠,取脾脏制备淋巴细胞悬液体外培养,分别以多房棘球绦虫抗原(EmAg)、刀豆素 A(ConA)刺激诱导白细胞介素 12(IL-12)、白细胞介素 10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ)；以脂多糖(LPS)刺激诱导肿瘤坏死因子 α(TNF2α),常规 ELISA测定脾细胞培养上清液中 IL-12、IL-10、IFN-γ和 TNF-α水平。结果表明与对照组相比,疫苗免疫组 IFN-γ、IL-12、TNF-α水平增加,IL-10水平降低,EmAg刺激组和 ConA或 LPS刺激组细胞因子水平明显高于相应的原疫苗组。可见多房棘球绦虫重组 Bb2EmⅡ/32Em142323疫苗可诱导攻击感染小鼠产生 Th1型细胞免疫应答,增强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。

3 展 望

目前,免疫抑制性的动物传染病日渐增多,急需免疫增强型的新型疫苗,或加强传统疫苗的免疫效果。以重组干扰素、白介素等作为免疫佐剂可能是解决目前众多疫苗,特别是寄生虫疫苗效果不良或不稳定问题的有效途径之一,是被人们普遍看好并具有广阔应用前景的新型佐剂。利用细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫,多种新型重组细胞因子,可以明显增强疫苗的抗体产生和细胞免疫水平,有效防治禽畜疾病,而且将在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。虽然目前对细胞因子如何参与免疫系统调控,增强重组疫苗的免疫应答有一定的认识,但仍存在较多问题。问题之一是对保护性免疫应答的本质尚不甚清楚。在哺乳动物,对病原的获得性保护通常是由于细胞免疫或体液免疫在起作用,然而,细胞免疫、体液免疫以及先天性免疫应答会在感染的不同阶段产生,要确定何种应答对保护起决定作用非常困难。另一个问题是由于重组细胞因子蛋白被直接注射到体内后会被迅速降解和清除,因此,如何优化免疫程序还有大量探索性工作要做。在某些情况下,免疫途径会影响细胞因子佐剂的效果。此外,能否将几种细胞因子联合使用也是人们感兴趣的问题。例如,IL-12与GM-CSF组合,以及 IL-4或 IL-2与 GM-CSF组合即将用于临床。总之,随着分子生物学技术发展,对细胞因子的研究将不断深入,细胞因子更多的生物学功能被人们所认识,其应用范围也越来越广泛。

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