重组人γ-干扰素摇瓶生产工艺优化

许崇利，胡静涛，许崇波

(1.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林 132022;2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;3.大连大学医学院，辽宁大连 116622;)

γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)是由活化的T细胞及NK细胞产生的一种多功能细胞因子，除了具有抗病毒活性外，还具有强大的免疫调节作用［1-5］。人γ-干扰素作为人体免疫调节剂对细胞癌、结肠癌及病毒感染类风湿关节炎、慢性肉芽肿瘤等均有良好的疗效，有着较为广阔的市场前景。由于天然γ-干扰素产量低、不易大量制备，限制了它的研究和临床应用。随着γ-干扰素基因的克隆和表达首先由美国Genetech公司的Gray等［6］于1982年完成。γ-干扰素的大批量生产并临床应用日益引起人们的重视。rhIFN-γ具有较高的疏水性，对宿主菌的毒害作用很大，采用一般的培养技术，重组菌菌体的产量很低，单位发酵液中目的蛋白产量难以提高。本研究以摇瓶发酵培养基的研究结果为基础，研究了在摇瓶中不同培养诱导温度和诱导时机等因素对工程菌生长和rhIFN-γ表达的影响，并优化了工程菌发酵参数，为发酵罐的生产提供了实验基础，最终实现rhIFN-γ的大规模生产。

1 材料

1.1 菌株 菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)由吉林化工学院基因工程药物实验室构建［7］。

1.2 培养基 M9Ⅰ培养基:1.6%Tryptone、1%Yeast extract、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.01%NH4Cl、0.06%(NH4)2SO4、0.05%MgSO4、0.25%Na2HPO4·12H2O。M9Ⅱ培养基:0.5%Glucose、0.5%Yeast extract、0.5%K2HPO4、0.35%KH2PO4、0.35%(NH4)2HPO4、0.025%MgSO4、2 mol/L 大肠杆菌用微量元素。M9Ⅲ培养基:0.5%CA、0.524%K2HPO4·3H2O、0.2%KH2PO4、0.12%(NH4)2SO4、0.05% 无水 MgSO4、0.02%NH4Cl、0.1% 甘油、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1 mol/L CaCl2、2 mol/L大肠杆菌用微量元素。

1.3 主要试剂 IPTG和氨苄青霉素购自Promega公司、酵母粉、蛋白胨等为国产试剂。大肠杆菌表达载体pET32a(+)及大肠杆菌 BL21(DE3)由吉林化工学院基因工程药物实验室保存。

2 方法

2.1 摇瓶种子的培养 挑取BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)单菌落转接至种子培养基中(50 mL锥形瓶中装入种子培养基20 mL(含50 μg/mL氨苄青霉素)，37℃ 200 r/min培养12～14 h。

2.2 摇瓶发酵培养 将培养好的种子液按2%接种量转接于发酵培养基中(250 mL锥形瓶中装入50 mL发酵培养基含50 μg/mL氨苄青霉素)，200 r/min 37℃培养，37℃诱导。

2.3 不同发酵培养基对rhIFN-γ表达影响 将种子液按2%接种量分别接种于三种改良的M9培养基(M9Ⅰ、M9Ⅱ、M9Ⅲ)中，于 37 ℃ 200 r/min 培养，待菌体密度 OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L的 IPTG，继续培养 3 h后取样，SDSPAGE 检测 rhIFN-γ 表达量［8］。

2.4 发酵初始pH对rhIFN-γ表达的影响 将M9Ⅲ发酵培养基 pH 值分别调为 6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4 和 7.6，然后分装于 200 mL 锥形瓶中，每瓶50 mL，按2%接种，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度 OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

2.5 诱导剂浓度对rhIFN-γ表达的影响 将种子液按2%的接种量接种于M9Ⅲ发酵培养基中，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度 OD600达到1.0时，分别加入终浓度分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

2.6 诱导温度对rhIFN-γ表达的影响 将M9Ⅲ发酵培养基的pH值调整至7.0，然后分装于200 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，按2%的接种量接种BL21(DE3)(pET32a(+)-rhIFN-γ)种子液，分别于28℃、30℃、32℃、35℃、37℃和40℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

2.7 菌体密度始对rhIFN-γ表达的影响 将种子液按2%的接种量接种于M9Ⅲ发酵培养基中，于37℃ 200 r/min培养，分别于菌体密度OD600达到0.8、1.0、1.2 时，加入终浓度为 1.0 mmol/L 的IPTG，继续培养3 h后，进行蛋白表达检测。

2.8 培养和诱导时间对rhIFN-γ表达的影响将种子液按2%的接种量接种于M9Ⅲ发酵培养基中，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.0 mmol/L 的 IPTG，分别于1、2、3、4、5 h 取样，进行蛋白表达检测。

3 结果

3.1 不同发酵培养基对rhIFN-γ表达影响 如图1～3所示，rhIFN-γ在三种改良的M9发酵培养基中均有表达，但在M9Ⅲ培养基中的表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量45.2%(见图3)。

图1 M9Ⅰ培养基rhIFN-γ表达SDS-PAGE电泳图

不同的发酵培养基对rhIFN-γ蛋白表达量有较大影响，考虑到M9Ⅲ培养基比较廉价，且可以高效表达rhIFN-γ，所以选择M9Ⅲ培养基作为小摇发酵实验的基础培养基。

3.2 发酵初始pH对rhIFN-γ表达的影响 如图4～6所示，不同初始pH值对rhIFN-γ蛋白表达水平有明显影响，其中pH值为7.0时，rhIFN-γ蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的42.6%(见图5)。因此选择pH7.0为最佳初始pH值条件。

图4 pH6.4、6.6、6.8 发酵液 SDS-PAGE 电泳图

图7 0.4、0.6 mmol/L IPTG诱导发酵液 SDS-PAGE电泳图

3.3 诱导剂浓度对rhIFN-γ表达的影响 如图7～9所示，不同的IPTG浓度对rhIFN-γ蛋白表达量的影响不同，当IPTG浓度达到1.0 mmol/L时rhIFN-γ蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的51.8%(见图8)。因此IPTG浓度控制在1.0 mmo/L较好，可以得到更高的表达水平。

图10 培养温度28℃、30℃发酵液SDS-PAGE电泳图

3.4 诱导温度对 rhIFN-γ表达的影响 如图10～12所示，不同的培养温度对rhIFN-γ蛋白表达量有较大的影响，当培养温度为37℃时rhIFN-γ蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量49.7%(见图12)。考虑到菌体生长速度，最后确定摇瓶培养温度为37℃，诱导温度为37℃。

3.5 诱导时机对rhIFN-γ表达的影响 当菌体密度OD600达到1.0进行诱导，rhIFN-γ蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的43.5%(见图13)。在此之前诱导细胞浓度低，在此之后诱导，由于细胞大量繁殖，培养基中营养物质被迅速消耗，加之有害代谢物的积累，使rhIFN-γ的生产能力较低。

3.6 不同培养、诱导时间对rhIFN-γ表达的影响在对数生长前期进行诱导，最有利于菌体生长和产物表达。只有工程菌处于对数生长时期，目的蛋白表达水平才最高，一旦工程菌进入稳定生长期再升温，目的蛋白表达水平反而会迅速下降。如图14所示，当诱导时间为3 h时，rhIFN-γ蛋白表达量最高，利用GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析，rhIFN-γ蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的41.2%。因此，选择3 h为最佳诱导时间。

3 讨论

本实验采用的工程菌通过热诱导表达目的蛋白质，诱导时机和诱导时间等因素对菌体的生长密度和目的蛋白表达水平均有有较大影响。工程菌处于对数生长期时，目的蛋白表达水平最高。诱导太早，菌体密度不高，诱导太迟，表达量低，本实验在菌体培养3 h后进行诱导，rhIFN-γ蛋白表达量最高。工程菌经热诱导后，细胞代谢旺盛，产物大量积累，但长时间高温诱导对细胞的生长和质粒的稳定性都会产生一定的影响，超过3 h之后，表达量逐步下降，因此选择OD6001.0，3 h为合适的诱导时机。培养基的pH值将影响微生物对营养物质的吸收、利用和代谢产物的分泌。细菌生长最佳pH值为6.8～7.4，过高或过低都不利于菌体的生长，本研究发现，初始pH 7.0时目的蛋白产量最高。IPTG为有效的诱导剂，但IPTG对大肠杆菌有一定的代谢毒性，且价格昂贵，所以确定IPTG的最低有效浓度，一方面可以降低对大肠杆菌代谢的毒性作用，另一方面可减少诱导蛋白表达的费用。试验显示在终浓度为1.0 mmol/L时产量最大。温度在诱导过程中除了影响氧的溶解度外，还会加速或延缓酶的反应速率，影响蛋白的性质［9］。试验显示培养和诱导温度为37℃时目的蛋白表达量最高。

摸索摇瓶发酵条件对确定发酵罐发酵工艺有着一定的借鉴意义，本实验优化的发酵条件为发酵起始pH值7.0、培养温度37℃、IPTG诱导浓度1.0 mmol/L、菌体生长密度 OD600达到 1.0时加入IPTG、诱导时间为3 h。本实验优化的发酵条件是稳定的，在后续的工作中，可以此为方向进行发酵罐发酵工艺的摸索，从而为rhIFN-γ批量生产奠定了良好的基础。

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