我国猪瘟流行新特点与疫苗免疫研究

宁宜宝，吴文福

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.广东永顺生物制药有限公司，广州 511365)

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种严重危害我国养猪业的烈性传染病。经过多年的努力，我们已经成功的控制了猪瘟在我国大范围的爆发流行。然而，近些年来猪瘟在我国出现了一些新的流行动向值得我们特别关注。疫苗免疫一直是控制猪瘟最为有效的方法，尽管我国培育出了享誉世界的猪瘟兔化弱毒疫苗株，但疫苗生产工艺一直是困扰我国猪瘟疫苗质量的一个非常头疼的问题，经过几年的潜心攻关，我国成功的研究出了猪瘟活疫苗(传代细胞源)，从根本上解决了猪瘟疫苗生产中存在的问题，有效地提高了疫苗质量，为在我国完全控制以致消灭猪瘟提供了可靠的技术保障。

1 目前我国猪瘟流行的新特点

近年来，我国猪瘟的流行特点发生了明显的变化:在成年商品猪，急性、典型性猪瘟病例在逐渐减少，多以非典型性、慢性及隐性猪瘟形式出现，局部区域散发流行较多，大区域积暴发流行少见;在种猪，猪瘟病毒持续带毒感染是目前最为头疼的问题，带毒母猪将猪瘟病毒经胎盘垂直传播给胚胎，即可引起严重的流产和弱死胎，又使带毒母猪的卵巢等生殖器官产生器质性病变，导致繁殖障碍［1］;在新生仔猪，经带毒母猪先天感染导致的死亡和免疫耐受是目前仔猪死亡的主要原因之一。

分子流行病学的调查结果显示，我国流行的猪瘟病毒基因型也在发生重大变化。中国兽医药品监察所等单位经对1979－2008年间我国近60个地区猪场获得的440多份猪瘟病毒样品的基因序列测定比较发现，目前我国流行的猪瘟病毒基因型主要为基因 2群，占 74.66%，基因 1群只占25.34%，而我国的猪瘟兔化弱毒疫苗株为基因1群。值得庆幸的是我国培养的猪瘟兔化弱毒疫苗对目前我国流行的所有基因型猪瘟野毒均能提供良好的免疫保护［2］。

目前，猪瘟流行特点的变化与种猪猪瘟病毒持续感染及疫苗免疫效果不尽人意有直接关系，繁殖障碍和疫苗免疫失败的问题应该引起我们高度关注。

2 猪瘟疫苗免疫失败的原因

2.1 种猪猪瘟野毒持续感染与垂直传播 持续感染猪瘟病毒的母猪将病毒经胎盘垂直感染胚胎是导致仔猪猪瘟疫苗免疫失败的重要原因。猪瘟病毒经胎盘感染胚胎后，流产常表现为弱胎、死胎和木乃伊胎，从死亡仔猪体内可分离到猪瘟病毒。宁宜宝等研究发现，持续带毒母猪所产仔猪的猪瘟病毒带毒阳性率达到50% ～100%，多为死胎，存活的仔猪出生后多在1周至10周内死亡，也有部分仔猪可以存活下来，成为隐性带毒猪［1］。

为了排除其他病原影响猪瘟免疫试验结果的准确性，我们在实验室用无猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、细小病毒等病原感染的试验猪用猪瘟野毒人工复制了病毒持续感染的带毒母猪动物模型。试验证明:此种带毒猪可以持续带毒500 d以上，成为猪瘟病毒的储存宿主。为了研究病毒持续感染母猪经胎盘垂直传播对仔猪影响，将其人工受精，结果产下的全是死胎，用猪瘟荧光抗体检查死胎均为猪瘟病毒阳性;将该母猪再次配种，产下的同样全是带毒的死胎，多为木乃伊胎，胎儿死亡时间比上一次明显提前了。此后对该母猪多次配种均失败，淘汰时解剖发现，该母猪的卵巢已完全结石化。为了解带毒母猪对同居猪水平传播情况，将健康阴性猪与之同居饲养，结果导致健康猪感染死亡，说明病毒持续感染带毒猪可造成同居猪感染。在实际工作中，由于这些持续感染带毒猪的存在，形成了猪瘟常发地区和猪瘟常发猪场。

2.2 猪瘟病毒子宫内感染导致仔猪先天免疫耐受带毒母猪将猪瘟病毒经胎盘垂直感染胚胎引起仔猪的免疫失败的现象表明，在这种经胎盘感染的仔猪出生后，吸允初乳，数日内病毒血症可一过性降低，但病毒仍存在于全身淋巴样组织和网状内皮组织，这种感染猪不能建立中和性抗体应答，形成免疫耐受，以至于对猪瘟疫苗免疫后不能产生免疫应答［3－4］。

我们模拟生产中的实际情况，对无临床症状的猪瘟阳性经产母猪所产仔猪进行免疫效力试验研究。两头母猪分别产下两窝仔猪，带毒率分别为5/11和12/14。同时按仔猪产出顺序隔头进行猪瘟兔化弱毒疫苗的零时接种，1小时后让所有仔猪吸吮初乳，然后，将实验猪用石门系强毒进行攻击，结果:攻毒前死亡的猪全是带毒猪;接种疫苗存活下来的5头仔猪在强毒攻击后死亡4头，与未免疫疫苗的对照组没有差异。结果证明:吃初乳和疫苗接种不能阻止带毒仔猪的死亡，免疫猪瘟疫苗不能使带毒仔猪产生免疫保护力。经胎盘感染猪瘟病毒的仔猪，可以形成免疫偏离现象或免疫耐受现象，导致免疫失败，甚至诱发猪瘟。

2.3 带毒种公猪通过精液将病毒传播给母猪造成胎儿感染 用RT－PCR检查带毒公猪自然交配所产死胎的猪瘟病毒基因型，结果表明:死胎所带的病毒基因型与母猪携带的猪瘟病毒基因型不同，而与公猪携带的病毒基因型相同。试验证明猪瘟病毒不仅能通过母猪垂直传播给胎儿，而且能通过公猪精液传播给胚胎，这是造成猪瘟持续感染的又一重要原因。

2.4 PPV、PRV和PRRSV混合感染对猪瘟疫苗免疫效果的影响 造成猪瘟持续感染的原因十分复杂，除持续感染猪瘟病毒的种猪经胎盘将病毒垂直传播给仔猪、猪瘟疫苗免疫效果不到位导致环境中猪瘟病毒感染在体内滞留以外，研究还证实，猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)混合感染均可造成CSFV在体内的滞留而造成持续感染。宁宜宝等利用6组20头CSFV、PRV、PRRSV抗原、抗体阴性猪分别利用PPV、PRV和PRRSV单独或混合感染7 d后，免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)，13 d后连同4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门系强毒。结果在攻击石门系强毒后2周，单独和混合感染了PPV、PRV和PRRSV后接种HCLV疫苗的4个免疫组12头中11头全为CSFV抗原检测强阳性反应;而单独免疫HCLV疫苗的4头猪在猪瘟强毒攻击后检测不到CSFV。试验表明PPV、PRV和PRRSV混合感染降低了猪瘟疫苗的免疫效果，导致猪瘟病毒感染后能在体内长期滞留［5］。

2.5 母源抗体及疫苗免疫程序对疫苗免疫的影响经试验表明，当母源中和抗体水平在1∶16时，使用2个免疫剂量的原代细胞猪瘟疫苗接种3头猪，在强毒攻击后，3头猪均有持续24～72 h的潜伏期，体温升高1.5～2℃，持续2.5～8 d;而使用4个剂量免疫接种的3头猪，仅1头体温升高2℃，持续时间仅为2.5 d。其他两头猪既无潜伏期，又无体温升高。我们在探讨猪瘟活疫苗(传代细胞源)不同免疫剂量分别接种不同母源抗体水平仔猪的血清抗体消长规律的研究中，采用猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测猪瘟母源抗体，按仔猪血清阻断率分为高(阻断率大于60%)、中(阻断率40% ～60%)、低(阻断率小于40%)，每头猪分别接种猪瘟活疫苗(传代细胞源)1头份、0.5头份和0.25头份，共9组。结果表明:每头猪分别接种猪瘟活疫苗(传代细胞源)1头份、0.5头份，不论母源抗体水平高、中、低，免疫后6周的抗体合格率达100%;而每头猪接种0.25头份，母源抗体水平低的仔猪，免疫后6周的抗体合格率可达100%，但母源抗体水平中、高的仔猪，免疫后6周的抗体合格率仅达60%。上述结果表明，提高疫苗中的病毒含量对母源抗体不整齐的猪场的猪瘟控制是非常必要的。此前，欧洲为了消灭猪瘟的亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。我国2005年版《中国兽药典》规定的猪瘟活疫苗免疫剂量和质量标准，远低于欧洲药典规定的标准，况且我国猪场中存在的猪瘟持续感染问题和其他病原混合感染的问题比发达国家严重的多，使用旧标准规定的免疫剂量预防接种，在母源抗体参差不齐和有猪瘟病毒持续感染的猪场，要想有效地控制猪瘟是不可能的。因此，提高疫苗的病毒含量和质量标准已迫在眉睫。

2.6 疫苗质量对免疫效果的影响 猪瘟疫苗的质量好坏，直接影响猪瘟的免疫效果。我国的猪瘟疫苗存在两大问题，一是疫苗中病毒含量低。在脾淋组织疫苗方面，我国现有猪瘟兔脾淋组织疫苗工艺落后，制造疫苗所需的健康合格兔数量太少，远远满足不了需要，同时疫苗中病毒含量低;在牛睾丸原代细胞疫苗方面存在病毒含量太低，在其他疫病病原，特别是免疫抑制性疾病病原单独或多重混合感染，母源抗体存在的情况下，很难达到应有的免疫效果。除此之外，由于牛感染BVDV非常普遍，用牛睾丸原代细胞生产疫苗，不可避免的会遭到BVDV污染［6］，污染了这种病毒，一是直接干扰猪瘟病毒在细胞中的增殖，同时还会由于使用污染的疫苗造成BVDV疾病的传播，直接影响胎儿存活，有试验证明:BVDV感染也可导致仔猪对猪瘟疫苗的免疫耐受［7］。运输的冷链系统不完善导致猪瘟疫苗中病毒存活力下降，也是引起猪瘟免疫失败的一个不可忽视的原因。

中国兽医药品监察所培育的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒是目前世界上最好的猪瘟疫苗种毒之一，世界上许多国家通过免疫接种这种疫苗，控制以至消灭了猪瘟。我们的实验室工作也证明，猪瘟兔化弱毒疫苗免疫接种猪可完全有效地抵抗各种我国流行的不同基因亚群猪瘟野毒株的攻击，可以看出，猪瘟兔化弱毒疫苗仍然是我国使用控制猪瘟非常有效的疫苗。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗有如此之多的优点，但在实际工作中，由于我们用牛睾丸原代细胞生产的疫苗没有解决病毒滴度低，外源病原BVDV污染的问题，疫苗质量仍受社会广泛关注，从根本上说，我国猪瘟的流行和屡控不止跟猪瘟疫苗的质量不高有着直接的关系。总体来讲，我国猪瘟疫苗存在的问题主要有以下几个方面:(1)猪瘟牛睾丸原代细胞疫苗:1)利用牛睾丸原代细胞制造的疫苗生产工艺不稳定，由于每次制造疫苗的细胞来源于不同的牛，批间差异大，病毒滴度太低，免疫效果差;2)由于牛BVDV感染阳性率非常高，利用牛睾丸细胞生产疫苗很容易受到BVDV的污染。BVDV与CSFV同属瘟病毒，均可导致仔猪胚胎发育不良或死亡，也可形成免疫耐受［8］。用污染BVDV的细胞生产疫苗，由于竞争抑制的原因，猪瘟病毒在细胞中的增殖会明显受到影响，这也是导致猪瘟牛睾丸原代细胞疫苗毒价低的主要原因之一。(2)猪瘟兔脾淋组织疫苗:1)猪瘟脾淋组织苗病毒含量低，以至于自上世纪50年代至今，我国猪瘟脾淋组织苗的质量标准仍然维持在每头份病毒含量150兔体感染量(RID)，远低于国际标准;2)制造疫苗所需的健康合格兔数量少，远远满足不了需要;3)生产工艺落后，利用动物组织制苗，易造成外源病原污染，由于当前我国缺乏制苗用兔的质量标准，特别是对兔体内的病原，如兔出血热病毒等，缺乏检测方法和质量标准，很难保证疫苗的纯净性;4)由于兔只个体与群体差异，猪瘟脾淋组织苗批间差异大，质量不稳定。

新近研究成功的用猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)生产的猪瘟疫苗则很好的解决了这一问题。ST细胞系与猪同源，适合猪瘟病毒增殖，由此细胞制造疫苗的病毒滴度比牛睾丸原代细胞生产的疫苗提高了20倍，ST细胞系可以建立细胞库控制细胞质量，使用无外源病原的细胞系生产疫苗不仅生产工艺稳定，同时又有效解决了疫苗中BVDV外源病原污染的问题。

3 我国猪瘟疫苗的发展历史和近期研究进展

3.1 发展历史 我国最早研究成功和投入使用的猪瘟疫苗是结晶紫灭活疫苗。疫苗制造是用猪瘟强毒感染猪，采集血液用结晶紫灭活制成，在早期我国尚无猪瘟活疫苗的情况下对控制猪瘟发挥了一定的作用。但由于需要用强毒感染猪制造疫苗，极易导致散毒等生物安全问题，灭活疫苗因其免疫效果较差，产量小，成本高，生产工艺落后，我国只在上世纪50年代使用过，后来停止了生产和使用，目前国际上也不使用灭活疫苗。

中国兽医药品监察所1954年成功培育出猪瘟兔化弱毒株，国际上将其称为“C株”，并将其制成了疫苗。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织，特别是扁桃体，但有时能从肾脏检查出疫苗毒抗原。该疫苗毒株不通过怀孕猪的胎盘屏障感染胎儿［9］。猪瘟兔化弱毒株在猪体内连续传代不会出现毒力返强;对所有猪均无致病性，接种各年龄的各品种猪，仅出现短暂轻微的病毒血症，不产生猪瘟临床症状，免疫猪与非免疫猪同圈饲养60 d，不发生接触感染。用荧光抗体检查免疫猪脏器带毒情况，证明免疫后7 d的猪体中扁桃体、脾及血存有微量毒，17 d以后，用免疫荧光技术检测免疫猪的扁桃体、脾、血液中已均检测不到病毒。免疫接种10～14日龄哺乳仔猪，不影响发育，注射怀孕1～3月母猪，不引起流产、死胎。由于该疫苗良好的安全性和免疫原性，该疫苗成为目前世界上应用最为广泛的疫苗［10］。该疫苗为东欧一些国家消灭猪瘟做出了重要贡献，

我国在1957年开始推广猪瘟兔化弱毒组织苗，最初提倡就地制苗，就地使用。随着上世纪70年代后期真空冷冻干燥技术的出现，猪瘟疫苗的生产工艺也发生了变化，冻干疫苗的研究成功使得疫苗便于保存和使用。起始采用大耳白兔接种猪瘟兔化弱毒，收取有典型体温反应的兔淋巴结、脾脏组织制苗，用其免疫猪对猪瘟防控起到了很好的效果;1974年我国用猪肾原代细胞培养兔化弱毒制苗，获得成功。1975年，中国兽医药品监察所组织全国兽医生物药品厂推广使用猪肾原代细胞工厂化生产猪瘟兔化弱毒疫苗，1978－1980年有13个兽医生物药品厂生产猪肾细胞苗，在全国大量使用。为了克服用同源组织原代细胞生产疫苗污染猪瘟强毒的问题，1985年犊牛睾丸细胞苗研制成功，为猪瘟疫苗生产开辟了一条新的道路。但随着近些年牛体内BVDV/BDV感染明显增加和对BVDV/BDV对猪危害的认识进一步加深，特别是由于BVDV经胎盘感染对仔猪产生免疫耐受和猪瘟牛睾丸原代细胞疫苗病毒含量太低等原因，常常导致猪瘟疫苗免疫失败和效果不尽人意。如何提高猪瘟疫苗病毒滴度，确保猪瘟疫苗免疫效力的问题又一次被提上了议事日程。而我国近几年研究成功利用猪睾丸细胞系生产的猪瘟疫苗有效的解决了这一问题。

3.2 猪睾丸(ST)细胞系新型猪瘟疫苗的研究 为了解决猪瘟牛睾丸原代细胞和兔脾脏、淋巴结生产组织疫苗存在的突出问题，中国兽医药品监察所和广东永顺生物制药有限公司联合开展了用传代细胞系生产猪瘟疫苗的研究。经过近几年的研究，取得了突破性进展。具体表现在以下几个方面:选择了一种对猪等动物安全、适宜于猪瘟病毒增殖的传代细胞系。将ST细胞系感染裸鼠，观察近100 d，没有发现致瘤现象，也没有观察到组织病理变化;将该细胞连传30代，染色体没有变化。证明该细胞系对猪是安全的。猪瘟兔化弱毒在该细胞中能实现高滴度增殖，通常情况下，每毫升细胞疫苗毒液的毒价能稳定在5×105～5×106RID，如果采用生物反应器，每毫升细胞疫苗毒液则可达到3×106RID，远远高于原代牛睾丸细胞猪瘟疫苗每毫升5×104RID的国家规程标准。由于猪瘟兔化弱毒良好的安全性，高病毒含量的传代细胞疫苗对猪安全，以30倍免疫剂量接种仔猪没有任何局部和全身不良反应，注射部位无显微组织病理变化。免疫效力检验结果显示，将该疫苗1/5 000免疫剂量免疫猪，仍能100%抵抗猪瘟强毒的攻击。高出牛睾丸原代细胞生产的疫苗近20倍。实验室免疫接种一次，第3 d便开始产生免疫保护，抗体阳性可维持15个月以上，13个月攻击猪瘟强毒，免疫猪100%获得免疫保护。免疫期可以达到一年以上。在农业部批准的16省市招标采购大面积推广使用证明:疫苗对各种品种、各种日龄的猪均安全有效，可大幅度提高免疫猪的抗体水平，对控制猪瘟的发生和流行发挥了很好的作用。

猪瘟活疫苗(传代细胞源)产品的优点主要表现在以下几个方面:因细胞系可建立细胞库，并经严格检验，细胞来源清晰、无污染，工艺生产稳定，批间差异小，质量容易控制，无BVDV等外源病原污染;与原代细胞疫苗国家质量标准相比，病毒滴度和免疫效力提高了20倍;使用剂量小，大大降低了免疫接种猪出现的过敏反应;病毒含量高，免疫效力好，可以减少母源抗体和其它病毒的混合感染对猪瘟疫苗的免疫干扰作用;免疫效果确实，高水平的细胞和体液免疫水平可以防止免疫猪的猪瘟病毒感染和带毒，使猪瘟从源头得到控制。

合理的猪瘟疫苗免疫程序对保证疫苗的免疫效果是至关重要的。在疫苗免疫接种程序方面，从我们的研究发现，早期感染是造成猪瘟疫苗免疫失败的主要原因，由此可见，在猪瘟流行地区，早期的疫苗免疫接种对尚未感染猪瘟病毒仔猪的预防控制非常重要。要提高猪群的猪瘟免疫抵抗力，首先要采用高质量的猪瘟疫苗。经近几年的大量临床试验结果表明:用猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫猪可有效提高猪场总的抗体水平，商品猪的抗体水平一般能维持在85%左右，种猪场可以达到90%以上，这对以往用原代细胞疫苗和组织疫苗免疫抗体水平不到70%是一个显著的提高，高水平的免疫抗体对控制猪瘟野毒感染有非常重要的作用。因目前养猪场的环境条件状况不一，在猪瘟控制净化好的猪场，早期的免疫接种不是太重要，但对猪瘟常发猪场，早期的疫苗免疫接种则显得尤为重要。普遍认为，对猪瘟比较严重的猪场和作为后备种猪培育的小猪，疫苗零时免疫接种是非常必要的。针对不同的猪场，我们制定了0－35－70日龄三次和30－70日龄两次的两种免疫接种程序，经猪场几年来大量使用证明，用两种免疫程序免疫猪均可产生良好的免疫保护力，只是侧重点有所不同。对作为后备母猪培育的仔猪，为了防止早期感染，便于建立无猪瘟病毒感染的后备种猪群，建议使用0－35－70日龄三次接种的免疫程序;对农村散养猪，目前实行的单纯的春秋两次预防接种对猪瘟控制来讲是远远不够的，必须对漏免和新引进的猪及时进行补免，使疫苗免疫全覆盖。对农户散养的后备种猪，同样需要进行零时免疫。

防控猪瘟重要的是两点，一是要保证种猪不感染猪瘟野毒，二是对所有猪加强疫苗免疫接种。经验证明，在保证种猪不带猪瘟野毒的情况下，如果商品猪的群体抗体阳性率保持在85%以上，种猪抗体阳性率达到95%以上，则猪瘟可以得到有效控制。

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