管碟法测定抗生素效价的影响因素及控制方法

蒋惠岚

(广西壮族自治区兽药监察所，南宁 530001)

管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法［1］。其原理是根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直经(面积)呈线性关系，比较标准品(S)与供试品(T)两者对接种的特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现透明的抑菌圈大小，计算出供试品的效价［2］。因为试验过程中影响结果的因素较多，任何一个环节操作不当或疏忽就会造成很大误差，甚至导致整组实验的失败。笔者根据多年的工作实践，对以下关键的影响因素进行了试验研究，并提出控制方法，供同行参考。

1 实验器材的影响

1.1 实验环境的选择 操作室要洁净，室内设有紫外灯，定期消毒，无抗生素的污染。操作台面要求水平平整，最好用大理石台面［2］。

1.2 实验器材的选择 双碟要求［2－4］碟底水平，无气泡。钢管要求［2］，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致，重量相等。钢管二端面不够平整可使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。钢管重量相同，能保证均匀扩散。移液管、容量瓶必须经过检定。

1.3 实验器材的清洗 玻璃双碟和钢管要特别注意清洁，如果因为清洗不干净而残留有抗生素或清洁液等污染，在下次实验中造成抑菌圈不正常现象。玻璃双碟和钢管先灭菌再清洗，玻璃双碟等其他玻璃容器最好用重铬酸钾硫酸洗液浸泡。钢管最好定期加洗衣粉置超声波清洗，再用流水多次冲洗干净，最后用纯化水冲洗3次。

2 试验菌的准备及影响

要及时做好实验菌的传代工作和和定期检查工作。一旦发现菌种老化，必须进行纯化、复壮，若污染杂菌则废弃不用，否则会引起抑菌圈不清晰，甚至无抑菌圈等异常现象。从工作中我们总结出如下经验，取纯种的冻干菌种复苏到营养琼脂平板上，从第一代开始从平板上挑选典型菌落接种至两支营养琼脂斜面，1支作为工作用菌种留下一次接种用(保种)，置4℃冰箱保存，另1支作为制作菌悬液使用，如此反复。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌可使用10代(每1个月传代1次);短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌可使用5代(每6个月传代1次)。制备好的芽孢菌悬液，置4℃冰箱保存，可使用6个月;金黄色葡萄球菌菌悬液，可使用1～2个月;藤黄微球菌菌悬液，可使用1～2个月;大肠杆菌菌悬液，可使用15～60 d。试验菌菌龄对抑菌圈边缘的清晰度影响较大，笔者做过试验菌菌龄对抑菌圈的影响，当天菌最清晰，15 d菌很清晰，30 d菌清晰，60 d菌清晰，90 d菌尚清晰，120 d菌欠清晰，150 d菌不清晰(芽孢菌除外)，甚至无抑菌圈，因此菌悬液的使用一般不超过3个月。

3 培养基对效价测定的影响

培养基有成品干粉培养基和自配培养基两种。干粉培养基按比例加水配制调节pH值后灭菌，使用方便，目前多用。干粉培养基以中国兽医药品监察所等的质量较好，特别是粘菌素干粉培养基，其抑菌圈清晰透明。自配培养基时蛋白胨、琼脂等的质量影响较大。培养基中原材料质量及培养基pH值对抑菌圈的边缘清晰度和试验结果的精密度影响较大［2，5－6］，如自配粘菌素培养基，如原料选择不当，常导致抑菌圈清晰度差，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌。

4 称量

5 稀释

宜采用容量瓶，稀释步骤一般不得过3步，每步取样量不得小于2 mL为宜。用吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始垂直放溶液，一定要把液体放完，特别是油性的液体最后要使吸管碰壁并停留半分钟。标准品与供试品溶解稀释的时间、所用缓冲液应尽量一致。

6 加菌悬液的加量是较关键的影响因素

新配制的菌悬液，正式试验前应先进行预试验，在上层培养基中分别加入不同浓度的菌悬液，以能使标准品高浓度所致的抑菌圈直径在18～22 mm的菌液浓度为试验用浓度。批量试验中后期，菌悬液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，其对抗生素的敏感度减小，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈(在供试品中含有两种以上抗生素时也可以产生双圈)。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌悬液在使用一段时间后，应逐渐加大菌悬液的使用量，但菌液使用到一定时间后，菌种对抗生素不敏感，这时不能再盲目加大量使用，必须重新配制。试验过程中如果所生成的抑菌圈太小，要减小菌悬液的加入量;如果所生成的抑菌圈太大，要增加菌悬液的加入量。表1为常用抗生素效价测定菌层培养基的参考加菌量，可供抑菌圈预测实验时的参考。

表1 常用抗生素效价测定菌层培养基的参考加菌量

7 双碟培养基的制备

7.1 底层培养基的制备 培养基在微波炉中完全熔化后，加注底层培养基20 mL均匀铺满整个双碟，应无气泡，若有气泡应用吸管戳破。注意培养基温度不可太低，应控制在70℃以上，温度太低培养基易析出及结块，甚至不能使用。

7.2 菌层的制备 菌层制备时培养基温度的掌握，一般菌(大肠杆菌等)培养基温度控制48～52℃，芽孢菌培养基温度控制50～65℃，温度过高会导致菌种死亡而无抑菌圈;温度过低培养基会凝固，菌悬液与培养基不能混匀，在底层培养基上不能均匀摊布，产生的抑菌圈不规则，误差增大。当加入菌悬液混匀以后，应尽快加注到底层培养基上，可直接用大口吸管吸取菌层培养基放在底层培养基双碟的中间部位，再迅速转动双碟，将培养基均匀摊布并铺满整个底层培养基，铺好的培养基表面应平整，如果不平整则加入钢管中的抗生素溶液会从钢管下缘流出，出现破圈，导致实验失败。

8 放置小钢管

尽量使用自动钢管放置器，以使钢管之间的距离均匀，避免距离过小，导致抑菌圈相连。放好后静置5 min，使之在琼脂内沉降稳定，再开始滴加抗生素溶液。

9 滴加抗生素溶液是最关键的影响因素

因为同一抑菌浓度的抗生素，其在钢管中的量大，抑菌圈大;量小，抑菌圈小。所以，每个钢管中抗生素效价单位数应尽量一致，以克服碟间差异，减小误差。

9.1 胶头滴管法(要求操作非常熟练)要按照SH→TH→SL→TL(二剂量法)滴加抗生素，滴加之前，滴管至少要用被滴加液体冲洗3次。在往小钢管中滴加抗生素溶液时，由于滴管内抗生素溶液往往会有气泡或者滴管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在菌层培养基表面造成破圈，也引起滴加体积不准确，滴管内千万不能有气泡。因此一旦滴管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加。胶头滴管管口应避免太细或太粗，滴加时离开钢管口距离不要太高，以免液体溅出;也不能太低而碰倒钢管。滴加中若有溅出，可用滤纸片或棉花轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入钢管后，没有与培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间(滴加抗生素溶液过快时容易形成)，导致培养后无抑菌圈的产生。此时可以小心的用滴管吸出钢管内的抗生素溶液，弃去，换滴管重新滴加。每次滴加抗生素溶液至钢管口平满。假如滴加过满，可以用滴管吸出。滴加溶液间隔时间不可过长，因为溶液的扩散时间不同影响测定结果。

9.2 移液枪(微量进样器)法 当用移液枪滴加抗生素溶液时以加入270 μL的体积最为合适，可以获得满意的可信限率(≤5%)。经过多次对比实验和多年的实践验证用移液枪加样更易操作和掌握，误差更小，更准确，可节约大量时间。建议把用移液枪滴加抗生素溶液的体积为270 μL写入《中国兽药典》，以便于广泛推广应用。

10 培养时间对效价测定的影响

按各品种要求置36℃培养16～18 h，根据需要可适当延长1～2 h，以抑菌圈清晰为好。根据经验粘菌素、庆大霉素、泰乐菌素等可适当延长1～2 h。

11 抑菌圈测量的影响

11.1 游标卡尺测量 测量抑菌圈直径，眼睛视线应与读数刻度垂直，游标卡尺测量的尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量，最好先测量标准品和样品高浓度抑菌圈，再测量低浓度抑菌圈，以减小游标卡尺大范围移动产生的测量误差，同时增加了相同浓度之间的可比性。记录测量结果后进行效价计算［1］和统计分析。

11.2 抑菌圈测定仪测量 自动测量，电脑测试、计算、统计分析打印结果即得。注意调整抑菌圈清析后再进行测量。尽量使用仪器测量以减小人为因素引起的实验误差。

12 讨论

利用管碟法测定抗生素效价具有准确、直观、重复性好、灵敏度高、便于操作等优点。其原理与临床医疗基本一致，能够直接显示抗生素的抗菌活性。不需要使用太贵重的仪器，成本不高，至今为止绝大多数抗生素都使用此方法测定含量。相关药厂和地市级药品检验所都能开展此项检验，关键是操作技术的熟练程度，对检测结果的准确性影响很大。笔者认为虽然影响因素较多，只要认真分析产生的原因，把上述影响因素控制好，消除影响，就能够使测量结果更准确，满足药品含量测定要求，提高测量结果的精密度和准确性。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 二○○五年版一部［S］.

［2］中国兽医药品监察所.兽药检验操作规程［S］.二○○五.

［3］刘金凤.抗生素微生物检定法操作体会［J］.中国药事，2004，18(3):200.

［4］余 萍，傅师一.用微生物法测定抗生素效价对双碟的技术要求［J］.中国兽药杂志，1994，28(4):34 －35.

［5］金录胜.管碟法测定抗生素效价中抑菌圈圆正及清晰度的控制［J］.中国兽药杂志，1993，27(2):36 －37.

［6］李 凡，朱志华，姜凤丽，等.管碟法测定生物效价影响因素的探讨及改进［J］.中国兽药杂志，2008，42(1):45 －48.