禽流感表位疫苗的研究进展

张文慧，钱爱东

(吉林农业大学，长春 130118)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病，除了可感染禽类外［1］，还可感染人、猪和马等多种动物，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疾病［2］。禽流感在世界各地暴发［3］，给养禽业造成了巨大的经济损失。自从1997年，有了人感染禽流感并致死病例的报道［4－5］，H5N1亚型禽流感病毒被普遍认为极有可能是下一次禽流感大流行的罪魁祸首［6］，严重威胁着人类的生命安全。大多数研究学者认为研制有效的流感疫苗是预防禽流感发生与传播的重要手段［7－11］。禽流感的疫苗研究主要有全病毒灭活疫苗、基因工程重组病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、转基因植物疫苗、反基因工程疫苗、抗独特性抗体疫苗、表位疫苗等。

表位疫苗是近几年发展起来的一种独特疫苗，它是以抗原表位为基础制备的疫苗。免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个抗原分子，而是识别抗原大分子上的一些特定的免疫活性基团并与其进行反应。抗原分子中这些负责和免疫细胞的抗原受体或抗体分子相结合，决定该抗原特异性的特殊化学基团称为表位。抗原表位是T细胞抗原受体和B细胞抗原受体及抗体特异结合的基本单位，在免疫应答中，根据T、B细胞抗原受体所识别的抗原表位的不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。文章就近年来禽流感表位疫苗的研究现状进行综述。

1 表位的筛选方法

目前研究报道的筛选表位疫苗候选表位的方法有单抗法、生物信息法、异源抗体对接法等。宋建领等［12］采用针对禽流感病毒M1蛋白的型特异性单克隆抗体，淘选M13噬菌体展示的12肽随机肽库。结果筛选到M1蛋白222～230位氨基酸(HPNSSARLR)序列构成了流感病毒型特异性表位。还有不少学者应用生物信息学的方法预测禽流感病毒的表位。王国戗等［13］应用免疫信息学的方法寻找不同来源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)的共同抗原表位。从GenBank下载不同来源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)的氨基酸序列，使用ClustalW1.83和SYFPEITHI生物学软件进行分析，选择和MHC I类分子结合比较强的抗原肽，有可能发展为H5N1亚型禽流感病毒表位疫苗，用来预防H5N1亚型禽流感。白靓等［14］使用生物信息学方法，对所下载序列进行预测与分析，获得H7N7亚型禽流感病毒血凝素B细胞和Th细胞相关抗原表位。通过H7亚型禽流感病毒阳性血清，初步验证所选表位抗原性。获得了5个H7N7亚型禽流感病毒候选B细胞和Th细胞表位。王开艳等［15］用生物信息学方法预测H1N1亚型流感病毒血凝素T和B细胞相关抗原表位，获得了三条候选Th和B细胞表位。梁瑾等［16］尝试用异源抗体对接方法对流感病毒血凝素B细胞构象表位预测进行可行性分析，基于蛋白质相互作用界面的形状互补理论，使用异源抗体的晶体结构同流感病毒血凝素的晶体结构进行刚性分子对接。李新生等［17］用禽流感病毒T细胞表位与体外重建鸡MHC I类分子结合的方法鉴定筛选的抗原表位多肽。筛选出KILTIYSTV和LLLAIVSLV两条禽流感病毒的候选表位。

2 表位疫苗的候选基因

禽流感病毒是负义的单链RNA病毒，基因组分为8 个节段，依次为 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。HA(血凝素)蛋白是流感病毒的主要保护性抗原，同时也是流感病毒抗原亚型分类的一个重要标记性抗原，可诱生保护性抗体及细胞免疫［18］，是当前流感疫苗的主要成分。目前禽流感疫苗的开发研制都主要是针对该蛋白的［19］。宋慧娟等［20］对禽流感病毒HA模拟表位的研究与性质的分析及类病毒颗粒融合蛋白的表达与活性分析、免疫原性分析，都为研制禽流感表位疫苗奠定了基础。

NA(神经氨酸酶)是流感病毒表面的另一类糖蛋白，其数量没有HA多，能促使被感染细胞释放出新产生的病毒颗粒，是流感病毒继续扩散和繁殖必不可少的。有的表位疫苗设计是针对NA蛋白的［21］。

在流感病毒的各个基因中，NP基因最保守，具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为A、B、C三个型。M的氨基酸序列很保守，在所有的禽流感病毒中，其序列几乎完全相同。针对NP和M蛋白设计的表位疫苗可以在不同亚型的禽流感病毒间通用。Guus F等［22］认为当禽流感疫情暴发体液免疫抵抗流感病毒是不够的，因此选择高度保守的M和NP蛋白的细胞毒性T细胞(CTL)表位是非常必要的。邓路瑶等［23］在A型流感病毒M1蛋白中找到了保守且有很强免疫原性的T细胞表位，并成功插入沙门氏茵SEF17茵毛基因agfA中。Bodewesa等［24］筛选出了 NP383～391一段9肽序列的CTL细胞表位。

仅针对禽流感病毒的单个抗原基因设计的表位疫苗，虽然也能诱导机体产生保护性免疫应答，但忽略了禽流感病毒的其他抗原成分。多表位疫苗是将禽流感病毒抗原基因中的抗原活性部位(包括B细胞表位和T细胞表位)串联在一起并插入真核表达质粒中构建而成的，避免了将多个抗原基因克隆入同一载体的困难以及可能引起的转录干扰问题［25］，而且不必构建多个单一质粒进行混合免疫就可充分发挥病原体中各个抗原成分的作用。Pushko等［26］将HA、NA和 M1蛋白的部分表位组合到一起，设计多表位疫苗。陈义锋等［27］筛选流感病毒主要抗原(HA、NA、NP、M)表位基因，以生物信息学软件优化其排列结构，合成流感通用的复合多表位基因，构建抗A型流感H3、H5、H7、H9亚型的重组质粒，将其转染幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)，检测到有效地转录和表达;而且其表达产物均能与相应的抗体特异性结合，证明了其具有一定的生物学活性和抗原性，有望成为抗多种A型流感病毒的通用表位疫苗。

3 表位疫苗的免疫效果

Pushko等［26］将针对禽流感病毒 HA、NA和M1蛋白的部分表位设计的多表位疫苗免疫BALB/c小鼠，具有良好的免疫效果。李新生等［28］对体外鉴定的禽流感病毒T细胞表位的免疫效果进行了研究。将来源于禽流感病毒的、可与鸡MHC I类分子结合的KILTIYSTV和LLLAIVSLV多肽免疫BALB/c小鼠，免疫后IFN－7的分泌量显著增长，能引起CD8+T淋巴细胞的额外增殖，刺激小鼠产生特异性CTL反应。贾雷立等［29］以流感病毒的主要抗原(NP、NA、M)表位的基因为基础，设计并合成大小为765 bp的复合多表位基因盒，并克隆入真核表达载体，构建的重组体对BALB/c小鼠进行免疫接种后，检测体液与细胞免疫指标，具有良好的免疫原性。彭金美等［30］以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒，分别肌注免疫30日龄SPF鸡，能够诱导机体产生特异性免疫应答，并在同型禽流感强毒攻击时对鸡提供了一定的保护。Shi－gui Yang等［31］构建的表位疫苗重组体VPR－VP22/HA和VPR－HA都具有良好的免疫效果，有望成为预防禽流感的表位疫苗。

4 表位疫苗研究的展望

通过众多研究学者们对禽流感表位疫苗的研究，笔者认为设计、研究由禽流感病毒多种抗原表位组成的多表位疫苗则能更有效的预防各种亚型禽流感的暴发。抗原表位是机体免疫系统识别抗原的主要化学基团，其氨基酸序列较短。抗原表位既能够有效地被免疫系统识别、递呈，又能诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫。而且可通过选择多个具有交叉保护性的抗原表位来预防多种亚型禽流感病毒毒株。同时较短的序列很容易合成，对载体的克隆能力要求较低，易于在载体中插人多个表位构建基因工程多表位疫苗。因此表位疫苗作为一种新型的抗禽流感疫苗，具有很好的发展前景。

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