miR-144在心血管系统疾病中的研究进展

马明仁，王菲，胡威，蔡晓庆，张鹏，原斌，马凌

解放军联勤保障部队第940医院心血管内科，兰州 730050

MicroRNA(miRNA)是动、植物中普遍存在的控制重要生物学进程的调节因子，也是研究最为广泛的一类非编码调节RNA[1-3]，包括外显子miRNA及内含子miRNA，长度18～25个核苷酸。miRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ转录生成前体miRNA(pri-miRNA)，然后经Drosha/pasha切割形成70个核苷酸左右的primiRNA，通过exportin-5等分子作用转运出核，在细胞质中由Dicer等加工为成熟miRNA，最后成熟miRNA分子与Argonaute蛋白等形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，并作用于特异靶mRNA的3'UTR，从而抑制翻译过程，通过去腺苷酸化和脱帽引起靶mRNA降解[4-5]。随着核酸高通量测序技术和生物信息学的逐步发展，利用基因芯片结合mRNA质/核比筛选及生物预测软件，众多与疾病相关的miRNAs及其靶基因相继被发掘。在心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)中，许多研究已经将miRNA作为病理生理过程及疾病预后的潜在生物标志物[6]。miR-144作为一种在进化上高度保守的miRNA，在人类定位于17号染色体上，以miR-144/miR-451基因簇形式存在，两个基因相隔93bp[7]。研究发现，miR-144在心肌细胞中高表达，其高表达可促进心肌氧化应激，从而诱发心肌损伤相关疾病的发生，并且已经证实其靶基因肿瘤抑制因子(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)涉及心肌细胞死亡信号通路，国内外多个临床试验也证实miR-144在心血管系统生理和正常发育以及CVD发生和发展中起关键作用[8]。本文就miR-144在CVD发生发展中的最新研究进展进行综述。

1 miR-144与冠心病

冠心病(coronary heart disease，CHD)是最常见的CVD，主要因为长期慢性炎症损伤动脉管壁，造成胆固醇沉积及血管重构而引起冠脉狭窄，主要病理过程为脂质代谢平衡的破坏及炎症反应的激活。前期研究发现，miRNA与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)及CHD的发生发展密切相关[9]， 且AS是导致CHD的主要原因。Cao等[10]研究发现，CHD患者血清中miR-144的表达量明显增高，可能在AS及CHD的病理过程中发挥重要作用，且miR-144水平与CHD严重程度相关，提示其可作为CHD的潜在生物标记物。脂代谢异常为CHD最主要的独立危险因素之一，已经证实miR-144可通过靶向ATP结合蛋白1(ATP binding cassette protein 1，ABCA1)来调节胆固醇代谢[11]，而miR-144的模拟物(mimics)可通过抑制ABCA1的表达降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，加速AS进程。miR-144-3p mimics可在细胞水平上诱导不同类型胆固醇明显上调，在复杂的体内平衡网络中对胆固醇代谢起关键作用，器官或组织中ABCA1的表达及活性降低会对脂蛋白亚类不同的AS保护功能产生负面影响[12-13]。也有研究证实，miR-144通过抑制ABCA1表达降低血清中HDL-C的水平，并能促进炎性因子的表达[14]。 miR-144的调节或许可为血脂异常及AS等血管疾病提供潜在的治疗手段。miR-144在脂质代谢及炎症因子产生中发挥重要作用。最近研究发现，CHD患者的血浆miR-144水平明显升高，且与CHD严重程度呈正相关，检测血浆miR-144水平可能有助于预测CHD及其严重程度[15]。

早期研究发现心脏中的关键转录因子GATA-4对miR-144/miR-451启动子有激活作用，miR-144/miR-451过表达增加了心肌细胞存活率，敲除则显示了相反的作用[16]。miR-144/miR-451靶向CUG三联体重复结合蛋白2(CUG triplet repeat,RNA binding protein 2，CUGBP2)，后者是一种广泛表达的RNA结合蛋白，可与环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) 的3'端相结合，在miR-144/miR-451过表达心肌细胞中，CUGBP2蛋白水平大大降低且COX-2活性明显增加，miR-144/miR-451基因簇至少部分靶向调节CUGBP2-COX-2途径，对模拟心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury，I/R)诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用[16]。Lusha等[17]证实，在大鼠I/R 模型中miR-144表达下调，miR-144通过靶向调节FOXO1减轻I/R损伤，过表达miR-144能够明显减轻心肌缺血损伤及细胞凋亡，在H9C2细胞实验中也验证了相似现象。在低氧条件下，骨髓间充质干细胞衍生的外泌体所含miR-144通过靶向调节PTEN/Akt途径来抑制心肌细胞凋亡[18]。研究发现，敲除miR-144能明显抑制细胞外基质重塑，增加心肌梗死区域面积，阻碍心脏重塑及功能恢复[19]。细胞迁移实验及体外成腔实验结果表明，miR-144可抑制细胞迁移及成管[20]。

越来越多的研究证据表明，miR-144与脂质代谢、炎性反应及心肌细胞凋亡相关，而脂类代谢异常又是CHD发生的重要因素。因此，miR-144与CHD之间的相关性可能为CHD诊疗提供更多可行方案。

2 miR-144与心律失常

心律失常的发生往往伴随多种离子通道及传导结构的改变，而miRNA在其中扮演的角色也逐渐被揭示。心房颤动(atrial fibrillation，AF)心脏电生理紊乱而导致的心脏异常搏动，是临床发病率最高的心律失常之一，其发病率随年龄增长而增高，可诱发心力衰竭、卒中及外周血管栓塞等致死性CVD。其发病机制有心房的电重构及结构重构，心肌代谢、神经体液及分子表达异常，心脏离子通道功能失调等[21-22]，病理基础主要是心房纤维化及心房扩张[23]。研究表明，miRNA与AF的发生及维持密切相关，循环miR-144在致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)伴室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)患者中表达丰度升高，提示miR-144可能对ARVC诊断有用，但ARVC中循环miRNA与组织miRNA之间的相关性仍有待进一步研究[24]。miR-144-3p在人肺成纤维化细胞中可促进纤维化相关基因如Ⅰ型胶原α1链基因(COL1A2)、胶原蛋白3α1(COL3A1)、平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)及纤维连接蛋白(fibronectin)的表达，在纤维化调控过程中发挥了重要作用[25]。Smad蛋白是转化生长因子-β(TGF-β)受体信号传导的中介物质，是调控纤维化的重要信号通路。进一步研究发现，miR-144-3p通过激活Smad3信号通路发挥促心肌纤维化作用，circRNA_100395通过结合miR-144-3p发挥抑制心肌纤维化的作用，且Smad3信号通路介导miR-144-3p参与了circRNA_100395的作用，从而抑制人心房肌成纤维细胞(HAFs)纤维化相关基因表达的调控[25]。

采用miRNA芯片筛选出永久性房颤(permanent atrial fibrillation，pAF)与健康心房组织中表达有显著差异的miRNAs，结果显示miR-144上调最为明显(10.44倍)，提示miR-144参与了pAF的发生及维持[26]。 有研究应用荧光定量PCR法检测高原低压低氧条件下大鼠血浆中miR-144的表达水平，结果发现，随着低压低氧暴露时间的延长，血浆miR-144表达水平逐渐升高，引起心肌损伤，继而引发了一系列CVD的发生，包括心律失常、心肌梗死、心力衰竭等[27]。

AF及pAF的病理基础均与心房纤维化密切相关，miR-144在心房纤维化进程中发挥了重要调控作用[28]。因此，随着对心律失常与miR-144相关性研究的不断深入，miR-144有望为心律失常的诊疗提供潜在靶点。

3 miR-144与先天性心脏病

先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是先天性畸形中最常见的类型[29]，约占各种先天性畸形的28%。CHD是指在胚胎发育时期由于心脏及大血管形成障碍或发育异常而引起的解剖结构异常，或出生后应自动关闭的通道未能闭合的情形。CHD种类复杂且繁多，一般分为3种：发绀型心脏病、左侧堵塞性缺陷及隔膜缺损。临床常见的类型主要包括房间隔缺损(atrial septal defect，ASD)、室间隔缺损(ventricular septum defect，VSD)及法洛四联症(tetralogy of Fallot，TOF)等。CHD发病原因较多，遗传因素仅占8%，而绝大多数则为环境因素所致。miRNA表达谱分析可检测到多种miRNAs在CHD中的表达发生变化，它们在心力衰竭、心律失常、心肌重构、心肌细胞生长分化及心脏发育等过程中发挥重要调控作用[30-32]。

目前认为TBX1基因是CHD的核心基因之一，但关于TBX1基因表达异常的研究较少。Cao等[33]研究发现，miR-144通过JAK2/STAT1途径靶向TBX1调节心肌细胞的增殖及凋亡。VSD是最常见的CHD，Li等[34]发现，与对照组儿童相比，VSD患儿心脏组织中miRNAs表达有显著变化。 TOF是存活婴儿中最常见的青紫型CHD，Zhang等[35]发现，与非配对捐赠心脏对照相比，TOF患儿心脏标本中有47个表达显著变化的miRNAs，包括miR-144，其中16个表达下调，31个表达上调。已证实双链复合蛋白8(paired box gene 8，Pax-8)参与了胚胎的心脏发育过程，与心肌细胞凋亡相关。在Pax-8基因敲除小鼠中，心脏出现VSD，心脏左心室壁及室间隔部位的心肌细胞存在明显的凋亡现象；通过筛选Pax-8基因敲除小鼠的miRNA表达谱，结合RT-PCR验证，发现miR-144明显上调，提示miR-144为促进心肌细胞凋亡的基因，并推测其参与了Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞凋亡的发生[36]。有研究发现，转基因斑马鱼高表达miR-144可明显影响胚胎内皮系统发育，胚胎节间血管(intersegmental blood vessel，ISV)生成严重受阻，miR-144靶向meis1基因表达在斑马鱼胚胎血管发育中有着重要的生物学功能[37]。 有学者将miR-144 mimics转染至大鼠胚胎心肌细胞H9C2使其高表达miR-144，结果发现，转染后caspase-3活性明显升高，而细胞增殖明显降低，细胞凋亡明显增加，推测miR-144可能通过增加caspase-3表达而促进心肌细胞凋亡，并抑制心肌细胞增殖[38]。miRNA可作为无创生物标志物应用于预测小儿CHD患者术后心肌损伤的程度及预后[39]。 孕妇孕前糖尿病(maternal pregestational diabetes mellitus，PGDM)会诱发胎儿CHD，PGDM诱导CHD的分子机制尚不清楚，生物信息学分析表明，PGDM明显改变了包括miR-144在内的149个miRNAs的表达，且发现了2111个与心脏发育途径相关的miRNAs靶基因，为进一步研究PGDM诱导CHD的分子机制提供了理论依据。

4 总结与展望

CVD是导致人类死亡的重要因素，约1/4的死亡与心脏疾病相关[40]。而miRNA作为一类新型基因调控小分子，在CVD各种生物学过程中具有举足轻重的作用。miRNA是目前研究最为广泛的一类内源性非编码RNA，人类20%～30%的基因转录受miRNA的调控。miRNA广泛参与了各个系统不同疾病的发生、发展，在CVD中也发挥了重要的调控作用。对miRNA的研究最早始于1993年Lee等[41]在秀丽隐形线虫中发现的miRNA lin-4，之后Reinhart等[42]发现了miRNA let-7及其调控基因，至此才引起人们对miRNA的高度关注。成熟miRNA序列很短(18～25个核苷酸)，且具有家族序列高度相似及低表达的特点。miRNA在病理状态下的差异表达、稳定性及组织特异性使其具有作为生物标志物的优势。随着生命科学研究的不断进步和发展，越来越多与疾病相关的功能性miRNA被发现和验证。

生物信息学预测分析miR-144序列高度保守，在参与调控信号通路过程中功能相对稳定，高度保守性决定了miR-144作为生物标志物的前提。miR-144在疾病中的调控作用研究主要集中在调控红系分化及肿瘤等领域，在心血管系统的报道相对较少。通过查阅相关文献发现，miR-144在CVD中的研究主要集中在胆固醇代谢、心肌细胞增殖和凋亡，以及心肌细胞纤维化等方面。miR-144在心肌细胞中高表达，可促进心肌氧化应激，从而诱发心肌损伤相关疾病。Pickard等[43]提出，最有前景且具有实验证据的心肌保护因子是基质衍生因子1α(stromal derived factor 1α，SDF-1α)、一氧化氮及miR-144，对肢体实施远程缺血后适应，则以上3种物质在血浆中浓度明显升高，而阻断这些因子可去除远程缺血后适应的心肌保护作用。远程缺血后适应及静脉内注射miR-144可明显减少急性I/R模型小鼠的心肌梗死面积[44]。miR-144通过靶向Rac-1改善线粒体的生物发生并减少细胞凋亡，从而保护心脏免受高血糖造成的损伤[45]。在小型猪心肌梗死模型中鉴定出84个与对照组表达有差异的miRNAs，且miR-144-3p在梗死区域的表达更高，miR-144-3p通过靶向PTEN增强心肌梗死后的心脏纤维化[46]。miR-144可能通过波形蛋白信号传导而调控AS的发展[37]。上述研究充分说明miR-144与CVD的发生发展密切相关，miR-144通过调节脂类代谢、抑制心肌细胞凋亡、促进心肌纤维化等参与了CVD的发生发展进程。

人的机体是一个复杂的体系，目前大多数研究只停留在单纯分析miR-144及其靶基因在某种疾病中的作用，且其研究方法均为通过生物信息学软件来预测miR-144靶基因，然后在细胞水平进行验证，但在体内的验证实验相对较少，尚不能全面系统地反映miR-144在体内的整体调控作用。大量实验证据表明，疾病的发生发展受到众多miRNAs调控，miR-144只是miRNA调控网络中的一个节点，在不同疾病中其表达和分布有高低之分，发挥的作用也有主次之别。已证实miR-144在心血管系统生理过程和正常发育以及CVD发生发展中起重要作用，因此，miR-144具备诊断及预测CVD的潜力。但miR-144作为CVD生物标记物也存在一些不足和弊端，如miR-144在CVD中发挥主要作用的同时，其他miRNA与miR-144的协调作用也会对CVD产生间接影响。miR-144水平的变化可能与特定的心脏病理生理机制存在交叉作用有关。miR-144作为CVD诊断和预后分析的生物标记物的有效性和安全性有待进一步考证。随着生物预测软件匹配度及准确性的提高以及高通量测序技术的不断发展，通过系统的实验逐步完善miR-144在CVD中作用的研究，全面了解miR-144在CVD中发挥的调控机制，将miR-144作为诊疗CVD的新靶点指日可待。