罗格列酮对动脉粥样硬化的影响及其机制研究

王梓良，钟一鸣，王小萍，周爱琴，曾石秀

(赣南医学院第一附属医院心内科，江西 赣州 341000)

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性的病理改变，是心血管疾病最主要的病因，高血脂与炎症反应被认为是动脉粥样硬化的关键因素[1-2]。随着社会的进步、生活方式的改变和人口老龄化进程的加速，动脉粥样硬化的发病率呈现上升和年轻化的趋势[3]。心血管疾病不仅严重影响我国居民的健康和生活质量，而且对家庭和社会造成严重的经济负担[4]。 动脉粥样硬化是系统性、进展性疾病。随着发病率及死亡率逐年上升，动脉粥样硬化常可有诱发急性心血管事件，如急性心肌梗塞、主动脉夹层等，严重危及生命，因而对动脉粥样硬化发生及发展的研究极其重要[5]。因此，积极干预动脉粥样硬化对防治心血管病具有重要的意义。本实验通过观察罗格列酮对动脉粥样硬化的影响，来探讨罗格列酮对动脉粥样硬化的影响及其可能的机制，为抗动脉粥样硬化治疗提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1材料与试剂清洁型SD大鼠均购置南方医科大学实验动物中心[许可证编号：SCXK(粤)2016-0041]，大鼠均为8周龄，雄性，体重240～260 g，罗格列酮片购置上海毕得医药科技有限公司，鼠抗PPARγ多克隆抗体、鼠抗PCNA单克隆抗体、大鼠α平滑肌肌动蛋白抗体、鼠抗人PDGF-B多克隆抗体均购置武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒购置广州宝汇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组50只SD大鼠随机分为5组，每组各10只，Ⅰ 组：正常对照组；Ⅱ 组：正常对照组+低剂量罗格列酮(3 mg·kg-1·d-1) ；Ⅲ组：模型组；Ⅳ组：模型组+低剂量罗格列酮 (3 mg·kg-1·d-1) ；Ⅴ组：模型组+高剂量罗格列酮 (9 mg·kg-1·d-1)。

1.2.2主动脉粥样硬化模型制作[6]及给药方法SD大鼠实验分组后，Ⅰ和Ⅱ组继续喂养普通饲料，Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组大鼠连续3 d腹腔注射维生素D360万IU·kg-1·d-1，并给予高脂饲料饲养(高脂饲料：1%胆固醇、0.1%丙硫氧嘧啶片、0.5%胆酸钠、3%猪油、5%白糖、3%香油、87.4%基础饲料)；Ⅰ和Ⅱ组给予等体积生理盐水腹腔注射，普通饲料饲养。从第4周后开始，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组开始用上述两种剂量罗格列酮治疗8周(每天给低剂量罗格列酮及高剂量罗格列酮加0.2 mL生理盐水灌胃)。于第12周末处死动物并留取标本。

1.2.3测定血清中血脂水平从第0周(实验开始前)和第12周末(试验结束时)这两个时间段于清晨空腹从大鼠鼠尾静脉采集血液1 mL，用全自动生化仪测定总胆固醇(TC)、低密度脂蛋自胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)的水平。

1.2.4动物处死及标本留取10%水合氯醛0.04 mL·10 g-1体重腹腔注射麻醉，剖开胸腔与腹腔，腹主动脉取血室温放置2小时1 000 g离心20分钟，取上置-20 ℃保存。 主动脉标本留取：取完整主动脉(从主动脉根部至髂总动脉分叉处)， 取3 mm主动脉以4%多聚甲醛固定，其余部分置于-80 ℃保存备用。

1.2.5组织病理学形态观察(1)主动脉油红“O”染色：取油红“O”0.5 g，加入异丙醇100 mL，充分溶解后避光贮存。染色时，取油红“O”溶液60 mL，加蒸馏水40 mL稀释，静置5分钟。将主动脉弓和胸主动脉全段浸入稀释液10分钟，转入70%酒精分色15分钟，自来水冲洗。数码相机拍照。应用Motic Images Advanced 3.0图像分析软件测定斑块面积与内膜面积比。(2)HE染色:每一标本取3张切片(普通玻片)作HE染色,每试验分组在HE染色片上随机选取10个视野测定内膜厚度。

1.2.6免疫组织化学法测定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、增殖细胞核抗原(PCNA)、血小板源性生长因子-B(PDGF-B)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)每一标本取3张切片(防脱玻片)，步骤参照免疫组化试剂盒说明书进行。用Motic Images Advanced 3.0 图像分析软件测定阳性产物的灰度值进行定量分析，每张切片40倍物镜下随机选取5个高倍视野计算平均值。

1.2.7 RT-PCR检测PPARγmRNA、PDGF-BmRNA及内参照GAPDHmRNA (1)引物合成：①PPARγ 扩增产物片断：201bp，上游引物：5' TGG GGA TGT CTC ATA ATG CCA 3'，下游引物：5' TTC CTG TCA AGA TCG CCC TCG 3'；②PDGF-B 扩增产物片断：259bp，上游引物：5' AGG AGG CCC ATC TAC ATC ATC ACC GAG T 3'，下游引物：5' CCT TTC ATG TCC AGC CAT GGG CCA CGT 3'；③GAPDH 扩增产物片断：476 bp，上游引物：5' GAG CTG AAC GGG AAA CTC AC 3'，下游引物：5' GGT CTG GGA TGG AAA CTG TG 3'。 (2)组织总RNA抽提：参照Trizol RNA 提取试剂盒说明书(Gibco 公司)的流程提取组织总RNA。(3)RT-PCR：参照反转录试剂盒(Promega公司)说明书进行。 (4)电泳及图像分析：应用Imagemaster VDS-CL对凝胶成像，计算PCR产物电泳条带灰度积分，并以GAPDH的灰度积分进行标准校对。目标基因PCR产物的相对量=目标基因电泳条带灰度积分/GAPDH电泳条带灰度积分。

2 结 果

2.1罗格列酮对血脂变化的影响如表1所示，大鼠经处理12周后血脂发生变化，模型组与正常对照组相比，血脂有明显升高(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮组、模型组+高剂量罗格列酮组与模型组相比较， TG明显降低(P<0.01)、HDL-C明显升高(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组相比较，TG进一步下降(P<0.05)，HDL-C进一步升高(P<0.05)。表明罗格列酮治疗可显著降低TG水平，升高HDL-C水平。

表1 第12周各组血脂水平比较

注：与正常对照组比较：﹡P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，▲P<0.01；与模型组+低剂量罗格列酮组比较：□P<0.05。

2.2罗格列酮对主动脉粥样硬化的影响

2.2.1各组主动脉斑块油红“O”染色如图1所示，大鼠经处理12周后，正常对照组及正常对照组+低剂量罗格列酮组大鼠主动脉内膜光滑，未见粥样斑块形成；模型组有严重的动脉粥样硬化病变，斑块融合成片，向管腔凸出；模型组+低剂量罗格列酮组斑块部分融合成片状，斑块减轻；模型组+高剂量罗格列酮组斑块明显减少。

2.2.2各组HE染色如图2所示，正常对照组及及正常对照组+低剂量罗格列酮组血管内膜光滑，排列整齐；模型组血管内膜不均匀明显增厚，斑块突向管腔，导致管腔变小，内膜中含有大量的泡沫细胞；模型组+低剂量罗格列酮组内膜增厚较病理对照组减轻，斑块减少，未见管腔阻塞；模型组+高剂量罗格列酮组内膜较均匀增厚，未见明显泡沫细胞浸润。

2.2.3各组斑块面积及内膜厚度测定如表2所示，模型组+低剂量罗格列酮组及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组相比较，斑块面积明显减少(P均<0.01)，模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组相比较，斑块面积减少(P<0.05)。模型组+低剂量罗格列酮组及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组相比较，内膜厚度明显减少(P均<0.01)，模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组相比较，内膜厚度减少，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组主动脉斑块油红“O”染色

图2 各组HE染色结果(×100倍)

组别 斑块面积百分比/%内膜/μm正常对照组03.15±0.60正常对照组+低剂量罗格列酮组03.15±0.60模型组81.3±3.41271.0±32.1模型组+低剂量罗格列酮组48.3±6.31▲185.2±21.6▲模型组+高剂量罗格列酮组16.3±3.12▲□143.1±20.3▲

注：与模型组比较：▲P<0.01；与模型组+低剂量罗格列酮组比较：□P<0.05。

2.3罗格列酮对PPARγ、PDGF-B、PCNA、α-SMA蛋白表达的影响

2.3.1 PPARγ蛋白表达如图3所示，模型组与正常对照组相比较，PPARγ阳性细胞率较高，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组比较，PPARγ阳性细胞率较低(P<0.01)，但仍明显高于正常对照组(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组相比较，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。表明动脉粥样硬化病变处PPARγ蛋白表达明显增加，罗格列酮干预治疗可抑制PPARγ蛋白表达。

2.3.2 PDGF-B蛋白表达如图4所示，模型组与正常对照组比较，PDGF-B蛋白表达明显增多，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组相比较，PDGF-B蛋白表达明显减少(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组比较，PDGF-B蛋白表达进一步降低，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。表明罗格列酮干预治疗可使PDGF-B蛋白水平降低。

图3 PPARγ阳性细胞率(%)

图4 各组PDGF-B平均灰度值

2.3.3 α-SMA蛋白表达如图5所示，模型组与正常对照组比较，α-SMA蛋白表达明显较少(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组比较，α-SMA蛋白表达明显增高(P<0.01)，但仍低于正常对照组(P<0.01)。表明罗格列酮干预治疗可抑制动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖。

2.3.4 PCNA蛋白表达如图6所示，模型组与正常对照组相比较，PCNA阳性细胞率明显增高(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组比较，PCNA阳性细胞率明显下降(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组比较，PCNA细胞阳性率进一步下降(P<0.01)。表明罗格列酮干预治疗可抑制动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞(VSMCs)的PCNA表达。

图5 各组α-SMA平均灰度值

图6 PCNA阳性细胞率(%)

2.3.5 PDGF-B与PCNA、α-SMA蛋白表达相关性分析PCNA表达与PDGF-B表达呈显著正相关(r=0.932，P<0.01)，α-SMA 表达与PDGF-B表达呈显著负相关(r=-0.748，P<0.01) 。

2.4罗格列酮对PPARγ、PDGF-BmRNA表达的影响

2.4.1 PPARγmRNA表达如表3所示，模型组与正常对照组比较，PPARγ mRNA表达明显增高(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组比较，PPARγ mRNA表达下降(P<0.01)，但仍明显高于正常对照组(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组比较，PPARγ mRNA表达进一步降低(P<0.05)。

2.4.2 PDGF-BmRNA表达如表3所示，模型组与正常对照组比较，PDGF-B mRNA表达明显增高(P<0.01)；模型组+低剂量罗格列酮及模型组+高剂量罗格列酮组与模型组比较，PDGF-B mRNA表达明显降低(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)；模型组+高剂量罗格列酮组与模型组+低剂量罗格列酮组比较，PDGF-B mRNA表达进一步下降(P<0.01)。表明罗格列酮干预治疗能明显降低动脉粥样硬化中血管PDGF-B表达。

表3 各组血管组织PPARγ、PDGF-B mRNA表达比较

注：与正常对照组比较：﹡P<0.01；与模型组比较：▲P<0.01；与模型组+低剂量罗格列酮组比较：□P<0.05，■P<0.01。

3 讨 论

噻唑烷二酮类药物(TZDs)是一种新型的胰岛素增敏剂,其药理作用主要是通过激活脂肪组织的过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPARγ),减少游离脂肪酸的生成，改善胰岛β细胞功能，罗格列酮和吡格列酮已广泛用于胰岛素抵抗和二型糖尿病的治疗[7]。过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)属于核内激素受体家族成员，也是一种转录因子，PPARγ能被过氧化物酶体增殖物激活而表达,表现为多种生物学功能，PPARγ在抗动脉粥样硬化、降血脂过程起着一定作用[8]。

在我们实验研究中,模型组PPARγ mRNA及蛋白水平均显著高于正常对照组，在用罗格列酮治疗后，干预治疗组动脉粥样硬化病变较模型组减轻，同时PPARγ mRNA及蛋白表达水平也下降，这与Marx，Delerive 等研究亦发现PPARγ在动脉粥样硬化处表达明显增加一致[9]，表明PPARγ在动脉粥样硬化中可能参与动脉粥样硬化的发生发展过程。另外，大鼠血脂水平在高脂喂养后均较正常对照组升高显著，表明大鼠的血脂代谢紊乱，其中以模型组最为严重，而通过罗格列酮治疗后TG明显下降，HDL-C显著升高，表明罗格列酮激活PPARγ，改善血脂代谢紊乱。有研究显示，罗格列酮有显著降低2型糖尿病患者中的TG水平，提高HDL-C水平[10-11]。

在本实验研究中，模型组与正常对照组相比，α-SMA明显下降，而罗格列酮治疗组与模型组相比，α-SMA显著升高，表明罗格列酮治疗可抑制动脉粥样硬化中VSMCs增殖。有研究显示，曲格列酮激活PPARγ后，调动诱导VSMCs产生收缩表型，抑制VSMCs的增殖，在心血管疾病中起保护作用[12-13]。另外在本实验研究中，PDGF-B的表达和PCNA的表达呈显著正相关，而PDGF-B的表达与α-SMA的表达呈显著负相关，表明在动脉粥样硬化中PDGF-B合成和分泌增加，而罗格列酮干预治疗可以抑制PDGF-B的表达，从而抑制PCNA表达，增加α-SMA表达，从而在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥抗动脉粥样硬化作用。