内镜辅助新西兰兔咽喉反流病动物模型建立方法的改进与比较*

代丽丽，汤维，尤悦，吴宏林，彭光华，陈朝辉，周雪华，耿爽，林笑含

（杭州师范大学附属医院 耳鼻咽喉科，浙江 杭州 310015）

咽喉反流病（laryngopharyngeal reflux disease，LPRD）是耳鼻咽喉科的常见病，因咽喉部受胃内容物反流侵袭，临床常表现为：咽干、咽痛、咽喉部异物感、咽喉部痰多、频繁清嗓、声音嘶哑、发声疲劳、喉痉挛、慢性咳嗽、窒息感及吞咽困难等[1-2]。近10%的耳鼻喉科门诊患者存在LPRD[3]。其中，近55%的声嘶患者存在LPRD[4]。体外实验是研究LPRD发生机制和探讨疗效的关键。因此，建立LPRD动物模型具有重要意义。目前，关于LPRD的动物模型以新西兰兔为主，多以食管内支架为基础建立模型，但各有优缺点。本研究在国内外相关研究的基础上，经过改进，建立方便易行的LPRD动物模型，旨在为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

选取2021年1月－2021年5月采用球囊扩张食管下括约肌（lower esophageal sphincter，LES）及食管上括约肌（upper esophageal sphincter，UES）来制造的，生理状态相似的健康普通级新西兰兔LPRD模型32 只，以随机数表法对其进行编号，并将实验兔分为实验A 组（n=11）、实验B 组（n=11）和对照组（n=10）。实验兔均为雄性，年龄5个月，体重2.5～3.0 kg。实验A组采用球囊扩张UES和LES；实验B组以食管内支架为基础扩张UES，联合球囊扩张LES[5-6]；对照组在UES及LES处置入食管球囊，但不行食管球囊扩张。所有实验兔在标准实验室环境下适应性饲养3 d，再行建模操作。比较3 组实验兔喉咽部喉镜下反流体征评分量表（reflux finding score，RFS）的评分，监测3组实验兔的喉咽部pH，并记录组织病理学变化[5-6]。本研究经杭州师范大学动物伦理委员会批准，严格遵循实验动物使用指南及福利原则。

1.2 材料

球囊扩张导管（南京微创，型号：BDC-10/55-7/18，直径10.0 mm，长度55.0 mm），压力泵（南京微创，长度1 800.0 mm），金属支架（南京微创，型号：MTNDA-S-8/50-2.7/1800，直径8.0 mm，长度5.0 cm），推送器[南京微创，内镜逆行胰胆管造影术（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）置入器，直径2.7 mm，长度1 800.0 mm，导丝：直径0.89 mm（0.035 in）]，咽喉反流监测使用Digitrapper™反流测试系统（Medtronic，美国），内镜系统及鼻窦内镜（欧亚，直径4.0 mm，长度175.0 mm）。实验兔购于余姚市泗门镇建飞实验兔养殖场[动物许可证号：SCXK（浙）2021-0004]。

1.3 建立新西兰兔模型手术方法及术后处理

术前分别禁饮禁食8 h。实验兔麻醉给予30 mg/kg 3%浓度的戊巴比妥钠耳缘静脉注射，麻醉后实验兔仰卧于手术台上，固定头部及四肢，以直角开口器撑开兔嘴。

1.3.1 食管球囊扩张LES经鼻胃管置入球囊至胃内，鼻胃管及球囊插入食管内的长度（以门齿为基准）约35 cm。其中，新西兰兔门齿距贲门的距离为22 cm，未扩张的球囊长度约6 cm，球囊前导丝约4 cm，鼻胃管内可见胃液反流。固定球囊，退出胃管约10 cm，然后将一定量的蒸馏水（约6 mL）注入球囊内以扩张球囊，向外拉球囊和鼻胃管，直至球囊的近端卡在胃贲门处无法向外拉。将球囊内蒸馏水抽干，固定鼻胃管，向外拉出球囊使其中点位于胃食管交界处。缓慢注入蒸馏水，使囊内压力加至10 psi（1 psi=6.895 kPa），维持5 min，充分扩张LES，中间休息3 min再重复扩张球囊一次，共扩张2次。见图1。

图1 球囊扩张LESFig.1 Balloon dilation of LES

1.3.2 食管球囊扩张UES经鼻胃管将球囊置入食管内，鼻胃管及球囊插入食管内的长度（以门齿为基准）约20 cm（门齿到环咽肌的长度约10 cm），固定球囊，向外拉鼻胃管约10 cm，在内镜直视下确定球囊位于环状软骨以下位置，向球囊内缓慢注入蒸馏水，使球囊内压力增加至10 psi，维持5 min，使UES 充分扩张，中间间隔3 min，共重复2 次。见图2。

图2 球囊扩张UESFig.2 Balloon dilation of UES

1.3.3 食管上段置入金属支架经鼻胃管将置入系统的导丝置入距离门齿约20 cm处的食管内。在内镜直视下，通过置入系统，将金属支架释放在食管内，弹开后，呈空心圆柱状的支架可提供支撑力支撑UES。在两侧臼齿中间的软腭处，固定支架顶端的丝线，防止支架位置变动以及丝线被实验兔咬断。24 h后剪断丝线并撤除。见图3。

图3 支架扩张UESFig.3 Stent dilation of UES

1.4 术后处理

手术中密切监测实验兔呼吸及心跳状况，如遇呼吸困难等情况，立即中止实验。为预防术后感染，术后30 min内，对实验兔肌肉注射40万u青霉素钠注射液。术后实验兔给予含5%糖盐水饲养，禁食24 h后，给予标准饲料饲养。

1.5 观察指标

1.5.1 一般状态术后定期观察3组实验兔的一般状态，包括：体重、食欲和死亡情况等，比较3组实验兔之间的差异。

1.5.2 新西兰兔上消化道2 h pH 监测采用pH监测系统监测所有实验兔术后第2 和4 周的24 h 上消化道pH值。①电极放置：采用盐酸羟甲唑啉（5 mL∶1.25 mg）收缩实验兔鼻黏膜血管，并用2%利多卡因胶浆行鼻黏膜表面麻醉，在pH 为4.0 和7.0 的缓冲液中校准电极，将电极从鼻腔经鼻咽部插入口咽部；在内镜直视下，将电极插入至食道入口下方，此时，探头与前鼻孔距离为11.0～12.0 cm；为防止电极移动，使用丝线缝合，电极固定于前鼻孔和鼻背部，在实验兔背部安装无线数据发射器，将电极线越过实验兔头顶与发射器连接，给实验兔穿上特制的衣服，防止实验设备脱落；记录2 h 内的实验兔喉咽部pH 值（图4）；②pH监测结果的获取[7]：实验结束后，使用仪器配套的分析软件（AccuView pH-Z）对所得数据进行分析，当pH值达到直立位＜5.5和卧位＜5.0时，视为1次反流事件[5]；记录2 h内咽喉反流的次数、反流时间占比和最长反流时间。建模成功的标准为：直立位2 h内，反流事件＞1次[8]（图5）。

图4 pH监测示意图Fig.4 Schematic diagram of pH monitoring

图5 pH监测系统Fig.5 pH monitoring system

1.5.3 喉镜检查和RFS分别于建模前3天和建模后4周，对实验兔采用喉镜检查并拍照，参照RFS对图像进行评分。评分系统包括：声门下、声带及喉弥漫性水肿、红斑或充血、肉芽肿、后联合增生、喉内黏稠黏液附着和喉室消失等[9]。

1.5.4 病理检查手术4 周后采用戊巴比妥钠（100 mg/kg）过量麻醉并处死所有实验兔，取UES 和声带等组织，采用10%甲醛溶液固定，石蜡切片后行HE染色，在光镜下观察组织病理学改变。

1.6 统计学方法

选用SPSS 22.0 软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，组内前后比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较及组内前后比较均采用Kruskal-WallisH秩和检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPRD建模结果

实验A 组11 只实验兔建模成功9 只，建模失败1只，建模死亡1只，死于喉梗阻。实验B组11只实验兔建模成功8 只，建模失败2 只，建模死亡1 只，死于肺部感染。对照组10只实验兔建模成功0只，建模失败10只，建模无死亡。实验A组和实验B组的建模成功率及死亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 喉镜RFS评分结果

实验A 组建模前3 天RFS 为（2.90±1.37）分，建模后4周为（8.60±2.32）分；实验B组建模前3天RFS为（3.10±1.20）分，建模后4周为（8.40±1.84）分；对照组建模前3天RFS评分为（2.40±1.35）分，建模后4周为（2.60±1.17）分。实验A组与实验B组组内建模前后RFS 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组建模前后无明显差异。见图6。

图6 3组新西兰兔术前及术后喉镜图像Fig.6 Preoperative and postoperative laryngoscopy images of three groups of New Zealand rabbits

2.3 咽喉部pH值监测结果

2.3.1 实验A 组和实验B 组建模前后建模成功的实验A 组，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流事件数（次）分别为0.00（0.00，0.00）、4.00（4.00，6.00）和4.00（2.75，5.00）次；建模成功的实验A组，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流时间百分率（%）分别为0.00（0.00，0.00）%、17.50（15.40，19.00）%和16.45（13.30，19.90）%；建模成功的实验A 组，建模前3 天、建模后2 和4 周的最长反流时间（s） 分别为0.00 （0.00，0.00）、27.00 （18.00，33.00）和20.00（17.75，24.75）s。建模成功的实验B 组，建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流事件数（次）分别为0.00（0.00，0.00）、4.00（2.75，5.00）和4.00（2.00，5.00）次；建模成功的实验B 组，建模前3天、建模后2和4周的酸反流时间百分率（%）分别为 0.00 （0.00， 0.00）% 、 17.50 （12.93，19.15）%和26.50（20.40，28.25）%；建模成功的实验B 组，建模前3 天、建模后2 和4 周的最长反流时间（s） 分别为0.00 （0.00，0.00）、25.50 （20.75，32.75）和23.00（15.50，27.00）s。实验A 组和实验B 组酸反流事件数（次）、酸反流时间百分率（%）及最长反流时间在建模前3 天、建模后2 和4 周组内比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3.2 对照组建模前后对照组建模前3天、建模后2和4周的酸反流事件数（次）分别为0.00（0.00，0.00）、1.00（1.00，1.75）和1.00（0.25，1.75）次；建模前3 天、建模后2 和4 周的酸反流时间百分率（%） 分别为0.00 （0.00，0.00）%、0.20 （0.10，2.75）%和0.80（0.28，1.50）%；建模前3 天、建模后2 和4 周的最长反流时间（s）分别为0.00（0.00，0.00）、2.50 （2.00，4.75） 和4.50 （3.00，7.00） s。对照组酸反流事件数（次）、酸反流时间百分率（%）及最长反流时间在建模前3 天、建模后2 和4 周组内比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3.3 3 组实验兔比较建模后2 和4 周，实验A组和实验B组酸反流事件数、最长反流时间和酸反流时间百分率较对照组均有提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验A 组和实验B 组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见附表。

附表 3组实验兔建模后2和4周观察指标比较 M（P25，P75）Attached table Comparison of observation indexes 2 and 4 weeks after the establishment of the model among the three groups of experimental rabbits M（P25，P75）

2.4 病理检查结果

对照组喉咽部及食管上端黏膜未见明显炎症。实验组食管及喉咽部黏膜均可见慢性炎症，喉咽部黏膜可见大量淋巴细胞和浆细胞浸润，伴腺体增生和间质水肿；食管黏膜表现为淋巴细胞浸润，局部鳞状上皮可见角化不全。见图7。

图7 3组病理特点Fig.7 Pathological features in three groups

3 讨论

对于LPRD发生机制的研究及治疗方法疗效的探讨，体外实验必不可少。因此，建立LPRD 动物模型，尤其是如何简便、安全地建立动物模型，是体外实验的基础，具有重要意义[10]。在实验动物的选择上，猪[11]和狗[12]因其咽喉黏膜上皮组织与人类最为相似，被认为是最佳的建模动物[13]。但存在建模周期长、购买价格贵、养育成本高和基因库相对不完善等问题。这使得新西兰兔[14-15]及大鼠[16-17]成为了应用最为广泛的实验动物。但是，鼠的咽喉黏膜与人非角化复层鳞状上皮不同，其角化上皮能抵抗一定的反流物，而兔的咽喉黏膜与人体组织相近，且对反流抗性弱，更易建模，具有良好的经济性。因此，兔成为建立LPRD动物模型的首选。目前，常见的建模方法基本都参照胃食管反流病动物模型的建模方式[18-19]，包括：外源性和内源性。外源性方法是指：在实验动物咽喉部涂抹一种或多种外源性物质，包括：胃酸、胃蛋白酶和胆盐等，模仿人咽喉反流物，刺激咽喉部上皮组织，使其产生炎症及溃疡，最终引起LPRD[20]。这种方法操作简单易行，对于实验动物的刺激性小，成活率高，劣势在于人咽喉反流物较为复杂，单一或者多种（胃酸、胃蛋白酶和胆盐等）外源物质不能完全模拟人咽喉反流物及LPRD的发生过程。而内源性方法则是通过咽喉手术，人为改变实验兔的胃肠道解剖结构，使反流屏障被破坏，从而达到加强动物自身胃肠内容物的反流效果，包括：贲门肌松弛术、贲门置管术、幽门缩窄术[21]、鼻饲管置管术[15]、LES 球囊扩张和UES 支架植入[5]等。内源性方法的优点在于：更加拟合LPRD的病理生理过程，可从发生机制上说明问题；缺点在于：手术及麻醉风险较大，对于术者要求高，动物成活率较外源性方法低。有研究[22-24]通过大鼠模型发现，减少大鼠睡眠时间和给予高脂饮食可诱发LPRD，该研究从病因学的角度对LPRD 动物模型进行探索，研究意义大，但建模时间过长，实验中混杂因素过多。

LPRD 相关机制的研究极少。胡颖[25]在新西兰兔模型的研究中发现，LPRD 的食道和喉上皮细胞间隙扩大，且在大鼠模型上发现claudin-3 表达水平明显降低。FENG 等[11]用巴马小型猪建立LPRD 模型，也证实了喉上皮细胞间隙扩大，并认为桥粒明显减少。这两项研究均可证明喉咽黏膜屏障被破坏。针对产生损伤的机制，有研究[26]基于新西兰兔模型发现：白细胞介素-8 和血管内皮生长因子可能与咽喉反流和喉癌的发病机制有关，但LPRD的相关机制仍需进一步开展。

本实验借鉴了LES 球囊扩张和UES 支架置入法，并予以改进。但原方法中UES金属支架固定困难，易脱落到胃中，难以保证UES扩张效果，且支架难以取出，金属支架多次使用后还会出现金属丝变形，可能损伤血管导致大出血，也可能破坏食管组织导致穿孔。因此，本研究通过球囊扩张UES，对UES解剖结构造成破坏。但在实验过程中发现：利用球囊对UES进行扩张易导致实验兔窒息，需在喉镜直视下操作，避免球囊导管扩张后堵塞声门。另外，本研究还发现，在进行LES球囊扩张后，直接上拉球囊进行UES球囊扩张，易引起喉痉挛及误吸，导致实验兔在手术过程中死亡；而在LES 球囊扩张后先从食管退出球囊，再重新插入食管，进行UES球囊扩张，可有效避免误吸及喉痉挛，降低死亡发生率。

本研究显示，有效扩张新西兰兔LES及UES可使实验兔形成LPRD；建模后pH值监测结果显示：实验兔各项反流指标均明显提高；组织病理学检查显示：实验组新西兰兔喉咽部及食道黏膜淋巴细胞广泛浸润，提示黏膜发生不同程度慢性炎症。这表明：通过有效扩张实验兔LES 及UES，可以建立LPRD 实验兔模型。本研究有效地扩张了新西兰兔LES及UES，且建模成功率高，符合LPRD病理生理过程，适用于体外研究，相较于LES球囊扩张联合UES支架固定，操作相对简便，术后死亡率更低。

综上所述，本研究通过扩张LES和UES，成功建立了LPRD 兔模型，经pH 监测、RFS 评分及病理检查，验证了模型的有效性，与LES球囊扩张和UES支架固定法相比较，成功率和死亡率差异无统计学意义。但本研究的建模方法具有一定的局限性：实验过程中，实验动物并发了较严重的胃食管反流。而临床中的LPRD患者常不伴有胃食管反流，本模型也无法对此做出解释[27]。目前，本研究团队致力于一种新型LPRD 检测试剂的开发，已在本模型上应用，并取得了较好的检测效果，为进一步开展临床试验及深入的分子机制研究奠定了基础，具有实用性。