香花油茶叶的茶多酚提取、纯化及其抗氧化活性研究

陈海燕，李沐晓，周则华，潘英明，杨 漓

（1.广西壮族自治区林业科学研究院 国家油茶工程技术研究中心热带地区油茶良种与栽培试验站，广西南宁 530002；2.浙江农林大学，浙江杭州 311300；3.广西贵港市平天山林场，广西贵港537100；4.广西师范大学，广西桂林 541001）

茶多酚通常从茶叶中提取，又名茶单宁和茶鞣质，由儿茶素类、黄酮类、花青甙类、酚酸类和缩酚酸类等30多种多羟基酚类化合物组成，其中儿茶素类化合物占茶多酚的60%～80%[1]，其次是黄酮类，其他酚类物质较少。研究人员对茶多酚的抗氧化性和生理活性等功能进行了系统的研究，研究表明其在抗氧化、抗病毒和抗辐射以达到防癌、抗癌、抑制肿瘤的作用及预防心血管类疾病等方面具有较好的功效[2-6]，被广泛应用于日用化工、食品和医疗保健等领域。

山茶属（Camellia）植物的叶片多富含茶多酚，香花油茶（C.osmantha）是2012年在广西南宁发现的山茶属短柱茶组新种[7]，国内外对其研究不多，主要集中在繁育、生理、茶油和园林绿化等方面[8-10]，关于香花油茶叶中提取茶多酚的研究较少。香花油茶叶中的茶多酚含量较高，其嫩叶的茶多酚含量可高达38%(以干叶计)，比通常用来提取茶多酚的茶叶高很多[11]。从茶叶中提取茶多酚的研究较多，提取方法有溶剂萃取法、离子沉淀法、柱子分离法、超临界CO2萃取法、酶提取法、微波提取法及超声波提取法等[12-15]。本研究在前人研究的基础上进行优化改进，先用超声-微波协同萃取，再用乙醇浸提，然后通过活性白土和酸性活性炭进行吸附，最后用无水乙醇进行纯化，醇沉后进行离心分离，上清液于旋转蒸发仪上浓缩，浓缩液置于真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品；将茶多酚成品用于猪油的抗氧化活性试验，检验其抗氧化活性能力。试验可为香花油茶的综合利用提供理论依据，为香花油茶提取茶多酚实现工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香花油茶叶采集自广西壮族自治区林业科学研究院油茶种质资源库5 ～10年生成年母树植株。

1.2 仪器

UV-2501PC 紫外分光光度计；FW100 高速万能粉碎机；JJ200 型电子分析天平；W-201B 数显恒温水浴锅；L530 台式低速离心机；250D 恒温光照培养箱；CW-2000型超声-微波协同萃取仪；SZCL-2A 数显智能控温磁力气搅拌器；VOS-30A真空干燥箱。

1.3 试剂

没食子酸标准品、福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂、无水乙醇、活性白土、酸性活性炭、猪油（自制）。试验用水均为蒸馏水；除特殊标注外，所用试剂均为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 茶多酚的提取

对采集的香花油茶嫩叶进行预处理，洗净并低温烘干，粉碎过筛（60目）备用。

称取一定量经过筛处理的香花油茶样品，放入超声-微波协同萃取仪的萃取瓶中，加入30 mL乙醇（浓度分别为20%、30%、40%、50%和60%），设定微波功率（150、250、350、450 和550 W）、超声功率（50 W）、萃取温度（50、60、70、80和90 ℃)、萃取时间（50、100、150、200和250 s）,萃取完成后，将萃取瓶中的香花油茶叶及萃取液倒入圆底烧瓶中，加入乙醇（与香花油茶叶原料料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35），搅拌均匀后放入水浴锅中浸提（时间分别为15、30、45、60 和75 min)，倒出浸提液于冰箱静置8 h，用离心机将浸提液分离，倒出上清液，重复以上操作3 次，将每次的浸取液分别放置。用旋转蒸发仪将上清液进行浓缩，回收乙醇，浓缩液置于已恒重的蒸发皿上，于真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品。称重并计算茶多酚质量，按照GB/T 8313-2018[16]的方法对茶多酚成品中茶多酚的含量进行检测，计算香花油茶叶中提取茶多酚的得率（茶多酚得，考察各因素对香花油茶叶中提取茶多酚得率的影响，确定香花油茶叶中茶多酚提取的最佳工艺条件。

1.4.2 茶多酚的纯化

在按照最佳工艺条件得到的茶多酚提取液中加入活性白土（10、20、30、40 和50 g/L)，置于磁力搅拌器上搅拌，重复搅拌吸附几次，将吸附后的茶多酚浸提液进行离心分离，上清液加入酸性活性炭（20、30、40、50 和60 g/L)，置于磁力搅拌器上搅拌，重复搅拌吸附几次，将吸附后的茶多酚浸提液进行离心分离，上清液置于旋转蒸发仪上浓缩，浓缩液加入无水乙醇（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）进行醇沉，醇沉后进行离心分离，上清液置于旋转蒸发仪上浓缩，浓缩液置于已恒重的蒸发皿上并放入真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品。称重并计算茶多酚质量，按照GB/T 8313-2018[16]的方法对茶多酚成品中茶多酚的含量进行检测，计算香花油茶叶中提取茶多酚的得率，考察各因素对香花油茶叶中茶多酚纯度及得率的影响，确定香花油茶叶中茶多酚纯化的最佳工艺条件。

1.4.3 抗氧化性能试验

取等量猪油30 g，分别加入12 个三角瓶中，在三角瓶中分别加入猪油质量的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.10%的茶多酚（茶多酚已通过酰化制成油溶性茶多酚，能完全溶于猪油），设1 个空白对照组。把三角瓶放入恒温光照培养箱中，设定温度60 ℃，每3 天按照GB 5009.227-2016[17]的方法测定猪油的过氧化值。

2 结果与分析

2.1 香花油茶叶中茶多酚的提取

2.1.1 乙醇浓度对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350 W、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、浸提次数2次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同浓度乙醇对茶多酚得率的影响。当乙醇浓度较低时，茶多酚得率较低，这是由于茶多酚在水中容易发生氧化反应，导致含量下降；随着乙醇浓度增加，乙醇抑制了氧化反应，茶多酚得率提高，当乙醇浓度为40% 时，茶多酚得率较高（12.18%）；乙醇浓度继续增加，得率变化不大，还有稍微下降的趋势，这是因为随着乙醇浓度的升高，香花油茶叶中的脂溶性物质浸出，茶多酚的杂质增加，得率下降；从经济成本各方面考虑，乙醇浓度选择40%为宜（图1）。

图1 乙醇浓度对茶多酚得率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentrations on yield of tea polyphenols

2.1.2 微波功率对茶多酚提取的影响

超声-微波协同萃取是近几年较新的一种浸提方法，利用微波的穿透性，使浸提液中的极性分子在微波电磁场中发生高频运动，分子间的频繁摩擦引起分子细胞内温度快速升高，细胞破裂，胞内有效成分快速流出，增大分子内有效成分的的扩散速率，达到快速、高效和节能的浸提效果。在超声功率50 W、超声-微波萃取时间100 s、乙醇浓度40%、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、浸提次数2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同微波功率对茶多酚得率的影响。茶多酚得率随着微波功率的增大而提高，但当微波功率超过350 W后，得率变化不大，说明过大的微波功率对茶多酚得率的提高没有帮助，而且微波功率过大会引起浸提液过热，叶中的颗粒扩散运动加剧，造成浸提液暴沸，茶多酚也容易发生氧化反应；综合考虑，微波功率选择350 W为宜（图2）。

图2 微波功率对茶多酚得率的影响Fig.2 Effect of power of microwave heating on yield of tea polyphenols

2.1.3 微波时间对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、浸提次数2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同微波时间对茶多酚得率的影响。当微波时间少于100 s 时，茶多酚得率随着微波时间的增加而提高；当微波时间多于100 s 时，随着微波时间的增加,茶多酚得率下降，这主要是由于随着微波时间的增加，浸提液的温度升高，茶多酚中的儿茶素类物质在浸提液中被氧化而缩合为不同程度的缩合产物（图3）。因此，微波时间选择100 s为宜。

图3 微波时间对茶多酚得率的影响Fig.3 Effect of time of microwave heating on yield of tea polyphenols

2.1.4 料液比对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、浸提次数2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同料液比对茶多酚得率的影响。茶多酚得率与料液比呈负相关关系，料液比越小，茶多酚得率越高；料液比小于1∶25，茶多酚得率的相对提高率不明显；料液比小则乙醇的用量增加，乙醇的回收增加生产成本，从经济效益考虑，料液比选择1∶25为宜（图4）。

图4 料液比对茶多酚得率的影响Fig.4 Effect of ratio of feed to liquid on yield of tea polyphenols

2.1.5 浸提温度对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提时间45 min、浸提次数2次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同浸提温度对茶多酚得率的影响。当温度低于70 ℃时，茶多酚得率与浸提温度呈正相关关系；当浸提温度高于70 ℃时，随着浸提温度的升高茶多酚得率变化不明显；当浸提温度达到90 ℃时，茶多酚得率略有下降（图5）。高温条件下茶多酚易发生氧化反应，导致得率下降，浸提温度选择70 ℃为宜。

图5 浸提温度对茶多酚得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of tea polyphenols

2.1.6 浸提时间对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提次数2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1 的条件下，考察不同浸提时间对茶多酚得率的影响。茶多酚得率随浸提时间的增加呈先上升后下降的趋势，45 min时得率最高（图6）。

图6 浸提时间对茶多酚得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on yield of tea polyphenols

2.1.7 浸提次数对茶多酚提取的影响

在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1的条件下，考察不同浸提次数对茶多酚得率的影响。浸提1次时，茶多酚得率较低；浸提3次时，茶多酚得率与浸提2 次时差别不大；从经济效益考虑，浸提2 次为最佳（图7）。

图7 浸提次数对茶多酚得率的影响Fig.7 Effects of times of extraction on yield of tea polyphenols

2.2 香花油茶叶中茶多酚的纯化

2.2.1 活性白土量对茶多酚纯化的影响

香花油茶叶提取液的化学组成复杂，除含有茶多酚外，还含有咖啡因、氨基酸、蛋白质、茶多糖、果胶、色素、维生素、芳香物、酶及无机盐等多种物质，活性白土能最大程度地去除其中的咖啡因和其他杂质，而且活性白土吸附后通过离心分离就能将沉淀分离，操作简便，成本低廉。在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提次数2 次、浸提时间45 min、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1的条件下，考察不同活性白土量对茶多酚纯度及回收率的影响。当活性白土量为10 g/L时，茶多酚回收率最高（18.78%），纯度最低（35.77%）；当活性白土量为50 g/L时，茶多酚纯度最佳（61.25%），回收率最低（8.46%）（图8）。综合考虑，活性白土量选择30 g/L为宜，此时纯度为60.06%，回收率为12.18%。

图8 活性白土量对茶多酚纯度及回收率的影响Fig.8 Effects of activated white soil quantity on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.2.2 酸性活性炭量对茶多酚纯化的影响

酸性活性炭对色素等杂质有较大的吸附作用。在超声功率50 W、微波功率350 W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提次数2 次、浸提时间45 min、活性白土量30 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1的条件下，考察不同酸性活性炭量对茶多酚纯度及回收率的影响。随着酸性活性炭量的增加，茶多酚的纯度提高，回收率降低；综合考虑，酸性活性炭量选择40 g/L为宜（图9）。

图9 酸性活性炭量对茶多酚纯度及回收率的影响Fig.9 Effects of acid activated carbon quantity on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.2.3 无水乙醇与浓缩液比对茶多酚纯化的影响

无水乙醇对茶多酚浓缩液进行醇沉，是一个溶解扩散沉淀的过程，多糖是水溶性的，不溶于无水乙醇，一些蛋白质、无机盐和果胶等也不溶于无水乙醇，通过醇沉可以把浓缩液中的多糖、蛋白质、无机盐和果胶等杂质去除，达到纯化茶多酚的目的。在超声功率50 W、微波功率350W、乙醇浓度40%、超声-微波萃取时间100 s、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提次数2 次、浸提时间45 min、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L 的条件下，考察不同无水乙醇与浓缩液比对茶多酚纯度及回收率的影响。随着无水乙醇与浓缩液比的增加，茶多酚的纯度提高，回收率降低；综合考虑，无水乙醇与浓缩液比4∶1为宜（图10）。

图10 无水乙醇与浓缩液比对茶多酚纯度及回收率的影响Fig.10 Effects of ratio of anhydrous ethanol to concentrated liquid on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.3 香花油茶茶多酚抗氧化活性

过氧化值的高低是评判猪油酸败程度的标准。与没有加入茶多酚的猪油相比，随着时间的增加，加入了茶多酚的猪油过氧化值的增加缓慢很多，由此可见，香花油茶叶中的茶多酚具有抗氧化活性，能延缓猪油中不饱和脂肪酸的氧化分解，延长油脂的质变酸败时间，延长油脂贮藏时间；当茶多酚的添加量为猪油质量的0.06%时，猪油的过氧化值随时间变化增加的速率最低（表1）。

表1 各处理的过氧化值Tab.1 Peroxide number of all treatments

3 结论与讨论

通过对超声-微波协同萃取茶多酚及纯化工艺关键技术的研究，确定了香花油茶叶中茶多酚提取与纯化的最佳工艺条件为超声功率50 W、微波功率350 W、超声-微波萃取时间100 s、乙醇浓度40%、料液比1∶25、浸提温度70 ℃、浸提时间45 min、浸提次数2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、无水乙醇与浓缩液比4∶1。在此条件下，香花油茶叶中的茶多酚提取得率为12.18%。

从香花油茶叶中提取的茶多酚对猪油具有良好的抗氧化性，试验表明，当添加量为油脂量的0.06%时，茶多酚对猪油的抗氧化效果最好。

香花油茶叶来源丰富，属废物利用，成本较低，从香花油茶叶中提取的茶多酚天然、无毒副作用且含量较高，其有望成为茶多酚提取的新原料。