骨肉瘤双硫死亡相关lncRNA 预后预测模型的构建与验证*

李威材 秦刚 何凯毅 苏国威 刘金富 肖世富 范以东 吴广涛 刘俊良

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年时期[1]，其恶性程度高，病变迅速，具有高度的转移倾向[2]。目前，新辅助化疗联合手术切除疗法和术后辅助化疗是OS 的主要治疗方法[3]。近年来，尽管OS 治疗进展提高了患者的生存率，但由于基因组的复杂性和不稳定性对OS 患者临床治疗产生的重大影响，转移性和复发性OS 患者的生存率仍然较低[4]。有报道局限性OS 患者的长期生存率约68%，而复发或转移性OS 患者的生存率仍低于30%[5]，严重影响患者的生存质量。因此，迫切需要探索可靠有效的预后生物标志物和治疗靶点，以指导OS 的临床决策和个性化治疗，从而提高OS 患者的生存率。

长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度超过200 个核苷酸的常见非编码RNA，可通过调节基因表达发挥生物功能，在癌症的发展和进展中发挥着重要作用[6]。双硫死亡是由二硫化物应激引起的一种全新的细胞死亡形式，其引起细胞死亡的机制不同于已知的铁死亡、细胞凋亡、自噬和坏死性凋亡等多种细胞死亡调节机制；当高表达的SLC7A11 与葡萄糖饥饿相结合时，细胞内会产生大量的二硫化物分子，诱导严重的二硫化物应激，最终导致肌动蛋白网络崩溃和细胞死亡[7]。溶质载体家族7 成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是一种人体胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白，其高表达水平与OS 细胞的增殖和迁移密切相关[8]。然而，双硫死亡基因在OS 和其他癌症中的机制和临床作用尚不清楚，关于双硫死亡相关 lncRNA（disulfidptosis-related lncRNAs，DRLncs）在OS 中所起作用的研究仍不明确。因此，深入研究DRLncs 在OS 中的作用机制对OS 患者的诊断、治疗和预后具有重要的临床价值。

本研究旨在通过生物信息学分析探讨DRLncs在OS 预后中的作用以及与免疫微环境和药物敏感性之间的关系，为OS 的临床治疗和预后机制的研究提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器下载88 例OS 患者的mRNA-seq 及临床数据和396 例正常肌肉骨骼组织样本，下载时间为2023年3 月。10 个双硫死亡相关基因（disulfidptosis-related genes，DRGs）从已发表的文章中获取[7]。

1.2 方法

1.2.1 差异表达DRGs 的筛选 排除3 例无完整生存数据的OS 组织样本后对数据进行批次矫正获取OS 相关的DRGs 表达矩阵，通过微阵列数据的线性模型（limma）包进行差异分析，以获得差异表达的DRGs。筛选标准为P＜0.05 和|logFC|＞1。

1.2.2 OS 相关DRLncs 的筛选及共表达网络的构建 使用R 软件“limma”包对差异表达DRGs 和lncRNA进行共表达分析获得DRLncs，以|Pearson 相关系数|＞0.4 和P＜0.001 为筛选标准[9]。

1.2.3 风险预后模型的构建 将OS 样本随机分为训练组（n=43）和测试组（n=42），所有患者的临床数据见表1，训练组和验证组中患者的临床特征比较差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。使用R 软件“survival”包对OS 数据进行单变量Cox 回归分析筛选出与OS 预后相关的DRLncs。在训练组中进行LASSO 回归分析，通过1 000 倍交叉验证进一步筛选出关键的DRLncs。获得的DRLncs 纳入多变量Cox 回归分析，以基于训练组中的最低赤池信息量准则（Akaike information criterion，AIC）值对模型进行优化，鉴定出用于构建OS 患者预后模型的DRLncs。使用以下公式确定了各分组中每个患者的风险评分，其中Coef（lncRNAi）表示相关系数，Expr（lncRNAi）表示DRLncs 的表达量。

表1 所有OS 患者的临床数据

表2 测试组与验证组中患者的临床特征

1.2.4 风险预后模型的验证 根据风险评分的中位数将各样本组分为高、低风险组，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）验证分组的准确性，对各分组进行生存分析、ROC 曲线以验证模型的准确性。通过独立预后分析，鉴定出独立预后的因素。最后构建列线图预测OS 患者的 1、3 和5 年生存率，并用校准曲线评估列线图的预后价值。

1.2.5 肿瘤微环境和免疫细胞浸润的评估 使用R软件“limma”“estimate” 和“ggpubr”包进行肿瘤微环境分析。利用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）分析总样本组中高、低风险组患者与免疫细胞和免疫功能的差异，使用“ggboxplot”包将结果可视化。

1.2.6 药物敏感性分析 为筛选治疗OS 患者的潜在药物，本研究使用R 软件“limma”、“ggpubr”和“oncoPredict”包对总样本数据进行药物敏感性分析，以P＜0.001 为筛选标准，预测两个风险亚组OS 患者潜在治疗药物的敏感性。

1.2.7 qRT-PCR 检测 为了进一步生物信息学分析的结果，本研究选取近10 年自广西中医药大学第一附属医院OS 患者的肿瘤组织及健康人的正常组织各30 例以用于进行qRT-PCR 实验验证。使用Trizol 试剂盒（购自美国Invitrogen 公司）从各受试组织中提取总RNA。使用HiFiScript cDNA 第一条链合成试剂盒（购自江苏省泰州市康为世纪公司）将总RNA 合成为cDNA。CFX ConnectTM荧光定量PCR 仪（购自美国Bio-Rad 公司）以95℃ 15 min 1 个循环，95℃10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40 个循环反应程序下进行qRT-PCR 定量每个基因的表达水平，β-actin 作为内参，并用2-△△CT方法计算。引物序列见表3，实验验证的OS 患者临床数据表4 所示。

表3 RERG-IT1、AL035446.1、AC010894.1 和β-actin 引物序列

表4 实验验证中OS 患者的临床数据

1.3 统计学分析

采用R.4.2.3、GraphPad Prism v8.2.1 和SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果采用（±s）表示，通过单因素方差分析确定统计学显著性。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OS 差异DRGs 和共表达DRLncs 的鉴定

共鉴定出RPN1、SLC7A11、GYS1、NDUFS1、NDUFA11、NCKAP1 6 个OS 差异表达DRGs（图1A）。通过共表达分析，鉴定出125 个OS 相关的DRLncs（图1B）。

图1 OS 数据样本中差异DRGs 的鉴定

2.2 风险预测模型的构建

单变量Cox 回归确定了AC005082.1、AC13910 0.2、AL035446.1、AC010894.1、RERG-IT1 5 种与OS预后相关的DRLncs（图2A）。通过LASSO 回归和多因素Cox 回归分析最终鉴定出3 个DRLncs 参与预后模型的构建（图2B～2D，表5）。使用以下公式计算风险评分：（0.678087244×RERG-IT1 expression）-（1.317581601×AL035446.1 expression）-（1.262917565×AC010894.1 expression），根据风险评分中位值分别将总样本组、训练组和验证组分为高风险组和低风险组。

图2 风险预后模型的构建

表5 多变量Cox 回归分析结果

2.3 风险预后模型的验证

PCA 结果表明，该风险预后预测模型能有效区分OS 患者的风险状态（图3）。生存分析显示，各分组中高风险组患者的死亡率均高于低风险组（图4）；死亡风险随着风险评分的增加逐渐上升（图5）。风险热图提示，随着风险值的增加，RERG-IT1 的表达水平逐渐增高，而AL035446.1 和AC010894.1 的表达水平逐步降低（图6）。ROC 曲线显示，各分组在1、3 和5 年时均显示较高的曲线下面积（area under curve，AUC），见图7。单因素和多因素Cox 回归分析表明，风险评分和肿瘤转移均可作为OS 患者独立的预后因素（图8）。利用独立预后因素构建列线图（图9A），结合校准曲线（图9B），表明预测结果与实际OS 生存率之间具有良好的一致性。

图3 主成分分析结果

图4 生存分析结果

图5 风险评分及生存状态

图6 风险热图

图7 ROC 曲线

图8 单因素和多因素Cox 回归分析结果（P＜0.05 表示差异具有统计学意义）

图9 列线图与校准曲线

2.4 风险预后模型与OS 患者的免疫微环境分析

肿瘤微环境分析结果显示，高危OS 患者的免疫评分和总分低于低危患者（图10A）。免疫细胞浸润箱线图（图10B）显示，与低风险患者相比，单核细胞和M2 巨噬细胞在高风险组显著下调（P＜0.05）。ssGSEA分析表明，在高风险组中，细胞溶解活性、APC 共同抑制、APC 共同激活和检查点等9 种免疫相关功能显著下调（图10C）。

图10 DRLncs 预后模型与肿瘤微环境、免疫细胞浸润和免疫功能之间的相关性

2.5 OS 药物敏感性分析

如低风险患者对瑞博西尼比高危组患者更敏感；然而高危患者则对BI-2 536 显示较高的敏感性（图11）。本研究结果表明，瑞博西尼和BI-2 536 可能是OS 的潜在治疗药物。

图11 高风险组和低风险组患者之间的药物敏感性分析（P＜0.05 表示差异具有统计学意义）

2.6 qRT-PCR 结果

qRT-PCR 结果显示，与正常组织相比，RERGIT1 在OS 组织中显著上调，而AL035446.1 和AC0 10894.1 则显著下调（图12），结果与此前分析结果一致，进一步验证了生物信息学分析的准确性。

图12 qRT-PCR 实验结果

3 讨论

OS 是儿童和青少年常见的恶性骨肿瘤，其复发率高、易发生转移，常导致OS 患者不良的预后[10]。因此，亟需寻找与OS 相关的新生物标志物以进一步改善OS 患者的预后。双硫死亡是一种新的细胞死亡形式，二硫化物的代谢可影响细胞的增殖与凋亡。二硫化物的代谢与氧化还原状态的调节密切相关，氧化还原状态是肿瘤发生发展的重要机制之一[11]。肿瘤细胞通过改变细胞内氧化还原环境来提高其存活率和耐受性[12]。二硫化物在肿瘤治疗中可能具有潜在的应用价值。Yue 等[13]研究发现，二烯丙基二硫化物可通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制人OS 细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移。因此，针对双硫死亡的治疗可能成为OS 临床治疗的新策略。lncRNA 与OS 的发生发展密切相关，可对OS 患者的预后进行预测[14]。然而，目前鲜见关于OS 中DRLncs 预后价值的研究报道。

本研究基于3 个DRLncs 构建了预后预测模型，在此模型中，RERG-IT1 可能是OS 预后不良的风险因子，而AL035446.1 和AC010894.1 则是保护因子，然而模型中3 个DRLncs 与OS 的相关研究鲜见报道。对此，本研究进行了实验验证，进一步验证了生物信息学分析的准确性。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）在OS 细胞的增殖和侵袭中发挥着重要作用[15]，lncRNA可通过影响TME 进而影响肿瘤的进展[16]。本研究显示，高风险组患者的免疫评分较低，与肿瘤的不良预后相关[17]。免疫浸润分析显示，高风险组OS 患者中的单核细胞和M2 巨噬细胞显著下调。低免疫评分的患者中M2 巨噬细胞水平显著降低，与风险评分呈负相关[18]。单核细胞浸润水平的降低常导致较差的免疫环境，从而促进肿瘤迁移[19]。9 种免疫相关功能在高风险组中下调，进一步验证了TME 和免疫浸润分析的结果。因此，本研究认为低免疫评分和弱免疫状态可能与OS 患者的不良预后有关。

本研究首次构建了OS 的DRLncs 预后模型，为OS 的临床治疗和预后机制研究提供了新方向。但本研究仍存在局限性：1）OS 数据样本过于单一，缺乏lncRNA 表达谱，易出现误差；2）DRLncs 在OS 诊断和治疗中的潜在机制需更多的实验进行验证。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。