甲基转移酶DNMT3b和SPG20甲基化在肺腺癌中的相关性研究*

赵宝山 邢志君 孙光蕊 张志民 张旭 梁宗英

原发性肺癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，严重影响了居民生命健康[1-2]。早发现、早治疗是降低肺癌病死率的关键[3]。传统观念认为癌症的发生和发展主要依赖于肿瘤相关基因序列的改变，但现代研究发现，肿瘤相关基因DNA 甲基化等表观遗传变化在肿瘤发生发展中发挥着重要作用[4]。已有研究发现，肺腺癌中部分基因甲基化变化影响基因表达，最终影响肺腺癌患者的预后[5-6]。SPG20 甲基化是肺腺癌患者肿瘤组织内特异性标志物，其甲基化水平随着病程进展而不断升高，但SPG20 基因甲基化诊断肺腺癌病变的敏感度相对较低。因此，探讨肺腺癌SPG20 基因甲基化状态及前期分子事件至关重要。DNA 甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b, DNMT3b）是DNMTs的重要成员，可促进全基因组的整体甲基化[7]，但DNMT3b 在不同肿瘤中对不同的基因甲基化作用并不一致。本研究旨在通过检测肺腺癌组织和癌旁组织中SPG20 基因的甲基化水平、SPG20 和DNMT3b的表达，分析肺腺癌进程中DNMT3b 表达与SPG20基因甲基化的相关性，探讨肺腺癌的发病机制，为诊疗提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本和细胞 选取自2020年4月至2021年4月于承德医学院附属医院经术后诊断为肺腺癌患者的组织标本70 例，试验组为70 例肺腺癌组织，对照组为70 例癌旁组织（距癌组织＞6 cm）。其中男性27 例，女性43 例；年龄＜60 岁28 例，年龄≥60 岁42例；TNM 分期Ⅰ期33 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期16 例；高分化6 例，中分化51 例，低分化13 例；有淋巴结转移13 例，无淋巴结转移57 例。纳入研究的患者均无其他肿瘤病史，手术前均无放化疗、免疫及靶向治疗史。本研究经本院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.1.2 试剂和仪器 甲基化修饰试剂盒购于德国QIAGEN 公司，焦磷酸测序试剂购于美国CST 公司，DNA 提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，RNA 干扰序列由广州锐博生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 焦磷酸测序检测SPG20 基因甲基化 使用组织或细胞DNA 提取试剂盒提取组织标本的总DNA，采用ED DNA 甲基化试剂盒对提取的DNA 进行亚硫酸盐转化。SPG20 基因甲基化扩增正向引物序列为5′-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3′，反向引物序列为5′-CCCCTCAAAATTAAACAACCT TTCTCTACA-3′。将扩增产物送深圳华大基因股份有限公司进行焦磷酸测序，采用PyroQ-CpG 软件自动分析每个位点的甲基化状态，计算甲基化率。

1.2.2 免疫组织化学法 将组织蜡块4 μm 切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精浸泡，滴加3%H2O2，室温放置10 min。破膜后，将切片放入柠檬酸缓冲液，置于微波炉中高温修复抗原12 min。切片自然冷却后，滴加山羊血清，室温放置20 min 进行封闭。清洗后，在湿盒中一抗（兔抗人DNMT3b 单克隆抗体为1:1 000；兔抗人SPG20 单克隆抗体为1:1 000）孵育4℃过夜。室温条件下，二抗（山羊抗兔）孵育30 min。DAB 显色，苏木素复染细胞核。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测SPG20 和DNMT3b mRNA 的表达 RNA 提取试剂盒提取组织和细胞总RNA。取300 ng RNA，使用RNA 反转录试剂盒按说明书进行反转录。使用SYBR Green qPCR Master 荧光定量试剂盒检测SPG20 和DNMT3b mRNA 的表达，各引序列见表1。相对表达量为2-ΔΔCt。

表1 各基因的实时荧光定量聚合酶链反应引物序列

1.2.4 细胞培养及转染 细胞常规培养基培养。采用脂质体介导法，将DNMT3b siRNA 和阴性对照siRNA 分别转染A549 细胞株。实验重复3 次。

1.3.5 Western blot 法检测组织及细胞内蛋白表达 提取组织或细胞内总蛋白并进行蛋白浓度测定。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并采用半干转膜法将总蛋白转移到PVDF 膜上。5% 脱脂奶粉室温封闭1 h 后，将膜放入稀释好的一抗中孵育40 min。漂洗后，将膜放入稀释好的二抗中孵育30 min。漂洗后，暗室中进行发光反应，并曝光至X-ray 胶片。采用Image Pro Plus 软件分析蛋白条带的积分光密度IOD 值，以目的蛋白的IOD 值和内参的IOD 值的比值反映各组目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计量资料资料符合正态分布、方差齐的数据采用x±s表示；计数资料采用χ2分析，配对样本采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 甲基化水平

SPG20 基因在癌组织中甲基化率为76.25%±5.74%，显著高于癌旁组织13.45%±2.41%，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 甲基化水平

2.2 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 和DNMT3b mRNA相对表达量

RT-qPCR 结果显示，SPG20 mRNA 相对表达量在癌组织中为0.18±0.03，低于癌旁组织的1.21±0.17，差异具有统计学意义（P＜0.05）。DNMT3b mRNA 相对表达量为1.62±0.27，高于癌旁组织的0.32±0.05，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 和DNMT3b mRNA 相对表达量

2.3 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 和DNMT3b 蛋白表达量

免疫组织化学检测结果显示，癌组织和癌旁组织中SPG20 蛋白阳性表达率为27.14%（19/70）和72.86%（51/70），差异具有统计学意义（P＜0.05）。癌组织和癌旁组织中DNMT3b 蛋白阳性表达率为75.71%（53/70）和22.86%（16/70），差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 肺腺癌和癌旁组织中DNMT3b 和SPG20 蛋白表达（SP ×200）

2.4 肺腺癌和癌旁组织中SPG20 和DNMT3b 蛋白表达量

Western blot 检测结果显示，DNMT3b 在癌组织中表达为68.57%±3.18%，高于癌旁组织25.29%±1.35%；SPG20 在癌组织中表达为16.87%±1.56%，低于癌旁组织58.75%±2.68%，差异均具有统计学意义（均P＜0.05，图4）。

图4 肺腺癌和癌旁组织中DNMT3b 和SPG20 蛋白表达

2.5 肺腺癌组织中SPG20 甲基化和DNMT3b 的相关性

SPG20 甲基化和DNMT3b 表达呈正相关（r=0.437，P＜0.05，表2）。

表2 癌组织中SPG20甲基化与DNMT3b表达的相关性（例）

2.6 肺腺癌组织中SPG20 甲基化及DNMT3b 与临床病理特征的相关性

SPG20 甲基化与肺腺癌TNM 分期、组织分化及淋巴结转移相关（P＜0.05），与性别和年龄无关（P＞0.05）。DNMT3b 阳性表达与TNM 分期、分化程度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与性别和年龄无相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 肺腺癌组织中SPG20 甲基化、DNMT3b 与临床病例特点的关系（n，%）

2.7 RNA 干扰下调DNMT3b后A549细胞中DNMT3b和SPG20 的表达

RT-qPCR 和Wesrern blot 结果显示，DNMT3b si-RNA、阴性对照和空白对照组中，以DNMT3b si-RNA 组中DNMT3b mRNA 和蛋白表达最低，而阴性对照和空白对照组DNMT3b mRNA 和蛋白表达差异无统计学意义，表明DNMT3b si-RNA 在A549 细胞中干扰成功（图5～7）。DNMT3b si-RNA 组中SPG20的mRNA 和蛋白表达最高，明显高于阴性对照和空白对照组，而阴性对照和空白对照组二者之间差异无统计学意义（图8，9）。

图5 RNA 干扰DNMT3b 转染A549 细胞荧光显微镜观察结果

图6 RNA 干扰DNMT3b 转染A549 细胞后DNMT3b mRNA 相对表达量

图7 RNA 干扰DNMT3b 转染A549 细胞后DNMT3b 蛋白表达量

图8 RNA 干扰DNMT3b 转染A549 细胞后SPG20mRNA 相对表达量

图9 RNA 干扰DNMT3b 转染A549 细胞后SPG20 蛋白表达量

2.8 Si-RNA 干扰DNMT3b 对肺腺癌A549 细胞SPG20 甲基化的影响

焦磷酸测序检测结果显示，DNMT3b si-RNA 组SPG20 甲基化水平最低，而阴性对照和空白对照组差异无统计学意义（P＜0.05），提示抑制DNMT3b 的表达可以明显降低A549 细胞中SPG20 甲基化水平（表4）。

表4 干扰DNMT3b 后各实验组细胞内SPG20 甲基化率（%）

3 讨论

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤，且发病年龄的年轻化趋势愈加明显[8]。肺癌具有发现晚、转移早、病死率高的特点，致使其患者的总体预后不佳[9-10]。研究表明，肺癌的发生是多个基因和多种因素共同参与导致的结果[11]。目前肺腺癌已经成为肺癌多种病理类型中最常见的一种，约占全部肺癌发病率一半以上。因此，提高肺腺癌的早期诊断率、发现评估预后的新指标和抗肿瘤治疗的新靶点是肺癌防治工作的重点[12-13]。

研究显示，表观遗传甲基化修饰参与多种肿瘤的发生和发展[14]。DNA 甲基化修饰的紊乱状态几乎存在于所有的肿瘤细胞内。细胞内异常的甲基化会导致机体基因表达异常，导致肿瘤的发展、转移和恶化[15-17]。SPG20 基因编码Spartin 多功能蛋白，参与人体多种疾病的发生。SPG20 在细胞分裂周期的异常作用与肿瘤的发生具有相关性；SPG20 启动子甲基化在肝癌和胃癌中的作用已经被证实，并作为肿瘤发展的早期事件[18-19]。本课题组前期的研究结果表明，SPG20 基因在肺腺癌组织内呈高甲基化状态，且与肺癌TNM病理分期及淋巴结转移密切相关。本研究再次通过检测肺腺癌样本，进一步证实SPG20 基因在癌组织中发生甲基化，且其甲基化率明显高于癌旁组织。肺腺癌组织中SPG20 的高甲基化状态与肿瘤的TNM 分期、分化以及淋巴结的转移具有相关性，说明SPG20 基因的高甲基化与肺腺癌的增殖、侵袭和转移具有一定的相关性，而癌组织中SPG20 mRNA 的表达水平明显低于癌旁组织，提示作为抑癌基因的SPG20 可能因发生甲基化而抑制SPG20 基因的转录，进而导致了蛋白的低表达。推测其可能因SPG20 高甲基化状态使其基因表达抑制或缺失，进而导致Spartin 蛋白减少或缺失，从而促进了肺腺癌的发生和发展。

甲基化修饰需要DNMTs 的参与，DNMTs 的动态变化而使得DNA 的高甲基化和低甲基化之间处于互相可逆的动态过程[20]。研究证实，在乳腺癌、前列腺癌及肝癌中已经成功通过外源性甲基供体SAM 高甲基化关键癌基因DNA[21-23]，实现了抑制癌基因的过表达，进而抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移。同时，外源性SAM 也具有直接抑制去甲基化酶的作用，提高细胞DNA 甲基化水平。研究发现，DNMTs 表达与结直肠癌甲基化异常有关，参与了结直肠癌的侵袭和转移。DNMT3b 是DNMTs 家族中重要的一员，可促进整体基因组甲基化，参与多种肿瘤的发生和发展[24]。DNMT3b 通过促进SETP9 甲基化促进肝星形细胞的活化和肝纤维化的发生[25]。本研究通过检测肺腺癌组织和癌旁组织中mRNA 和蛋白表达，证实癌组织中DNMT3b mRNA 和蛋白的表达均明显高于癌旁组织，且其癌组织中的阳性表达与肺腺癌的TNM 分期、肿瘤分化和淋巴结转移密切相关。随着肿瘤分期的增加、肿瘤分化的降低，DNMT3b 蛋白的表达量逐渐上升，肿瘤淋巴结转移患者中的表达明显升高，提示其可能促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，进而使得肺腺癌的恶性程度增强，导致其容易通过淋巴结发生转移。

研究证实，下调或沉默DNMTs 的表达可以使肿瘤细胞的整体基因组甲基化率下降。联合降低多种DNMTs 可使肿瘤细胞的整体基因甲基化率明显下降[26]，沉默DNMT3b 有可能发挥更高的去甲基化及抑制肿瘤细胞的作用。有研究证实，抑制甲基化转移酶的表达后，不同的基因在不同的肿瘤细胞中去甲基化水平亦不相同[27]，提示DNMT3b 在不同肿瘤中对不同基因甲基化的调控结局并不一致。但在肺腺癌中，DNMT3b 作为甲基化转移酶是否参与SPG20 高甲基化的关系尚不明确。本研究通过分析DNMT3b 和SPG20 甲基化水平相关性显示，在肺腺癌组织中SPG20 高甲基化与DNMT3b 的阳性表达呈正相关，提示DNMT3b 作为DNMTs 可能参与了SPG20 基因的甲基化，促进了肺腺癌的增殖、侵袭和转移。进一步通过体外细胞实验验证甲基化转移酶DNMT3b 与SPG20 甲基化的相关性。结果显示，RNA 干扰下调DNMT3b 后SPG20 基因甲基化率明显降低，SPG20 mRNA 和蛋白表达均明显上升。提示抑制DNMT3b的表达可以降低SPG20 基因甲基化率，促进SPG20的表达，进而发挥其促癌作用。

综上所述，在肺腺癌中DNMT3b 的表达与SPG20甲基化水平密切相关，DNMT3b 的高表达促进了SPG20 的高甲基化状态，二者可能是促进肺腺癌发生发展的重要生物学特征。将来可以DNMT3b 及SPG20 甲基化修饰作为切入点，深入研究其具体致癌机制，为肺腺癌的基因靶向治疗提供新的理论依据。