卵巢上皮性癌组织中长链非编码RNA PURPL的表达及其意义*

何婷婷 张瑞涛 史惠蓉 曹媛 冯巍 王文文 张微微

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）可在基因转录和转录后水平发挥重要的调节功能，参与细胞增殖、凋亡、转移、代谢、维持基因稳定性和化疗耐药等多种生理病理过程[1]，lncRNAs 与恶性肿瘤的发病密切相关。研究显示，在胃癌组织中可检测到长链非编码RNA PURPL（p53 upregulated regulator of p53 levels）的表达水平明显高于癌旁组织，且与肿瘤的直径、临床分期密切相关，提示PURPL 与胃癌患者预后不良相关[2]。本课题组前期研究了微小RNA-338-3p（microRNA-338-3p，miRNA-338-3p）及其靶基因MET 转录调节因子MACC1 表达异常与卵巢癌发生发展的关系[3]，ENCORI 数据库检索提示PURPL 可靶向调节miRNA-338-3p。目前，在卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）组织中的PURPL 表达鲜有报道，本研究旨在初步分析PURPL 在卵巢癌组织中的表达情况及其与卵巢癌患者预后的关系，为进一步研究PURPL 参与卵巢癌发病的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集2012年10月至20215年10月郑州大学第一附属医院105 例患者的临床病理资料，其中包括正常卵巢组织20 例、良性卵巢上皮性肿瘤组织20 例、EOC 组织65 例，年龄分别为（45～62）岁、（25～48）岁、（28～76）岁，中位年龄分别为51、39、50 岁。所有患者病例资料详见本课题组前期报道[4]。本研究经本院道德伦理委员会批准，并获得患者或家属知情同意。

1.1.2 主要试剂 组织RNA 提取试剂Trizol、cDNA-反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒分别购自美国Invitrogen、加拿大Fermentas、大连Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 医学数据库检索 选用开放医学数据库lnc-RNASNP2 和GEPIA 检索PURPL 在人类恶性肿瘤组织和配对的正常组织中的表达差异，使用Kaplan-Meier Plotter 数据库检索PURPL 与EOC 预后的关系。

1.2.2 实时荧光定量PCR 检测 组织总RNA 使用Trizol 提取，经纯化、定量、反转录，进而参照SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒说明书构建反应体系进行PCR 反应，以β-actin 作为内参。PCR 所用引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列为PURPL 正义：ACACGGGGCTTGAGAAATGA，反义：TCAATC TCCAAAATAGCCGGA；β-actin 正义：CATGTACGT TGCTATCCAGGC，反义：CTCCTTAATGTCACGC ACGAT。PCR 反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，共40 个循环。每次PCR实验重复3 次，相对表达量采用2-ΔΔCt计算。ΔΔCt=实验样本ΔCt-校准样本ΔCt。

1.2.3 随访 随访时间为16～61 个月，中位随访时间为38 个月，随访结束时65 例EOC 患者中46 例生存，19 例死亡。研究的终点事件分别为患者死亡或无复发生存，如患者在随访结束时未死亡或未复发则定义为截尾事件，统计时予以删失。死亡时间定义为随访开始至患者因肿瘤原因导致死亡的时间，无复发生存时间定义为随访开始至患者因肿瘤原因导致复发的时间。随访截止至2018年2月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。采用Graph Pad Prism 7 软件绘图。相对表达量采用x¯±s表示，表达差异性检验采用单因素ANOVA 分析和LSD-t检验，相关性分析采用χ2检验或Fisher 精确概率法，Kaplan-Meier 法绘制生存曲线分析总生存率和无复发生存期。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 数据库检索

经lncRNASNP2 和GEPIA 数据库检索，与配对的正常组织相比，在多种人类恶性肿瘤组织中PURPL 高表达，其中包括EOC（图1）。经Kaplan-Meier Plotter 数据库分析，PURPL 高表达与EOC 患者的无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）和总生存期（overall survival，OS）缩短相关（图2）。

图1 人类不同恶性肿瘤癌组织及其配对的正常组织中的PURPL 表达

图2 PURPL 表达与EOC 患者RFS 和OS 的关系

2.2 不同卵巢组织中PURPL 的表达

实时荧光定量PCR 检测结果显示，在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、早期EOC 组织和晚期EOC组织中PURPL 的相对表达量分别为0.029±0.001、0.135±0.001、0.488±0.006 和0.530±0.004。与正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织相比，EOC 组织中PURPL 的表达明显升高（F=4 836.000，P＜0.000 1），且晚期EOC 组织中PURPL 的相对表达量（0.530±0.004）明显高于早期EOC 组织的（0.488±0.006），两者比较具有显著性差异（t=4.918，P＜0.000 1）。

2.3 EOC 组织中PURPL 的表达与临床病理指标的关系

65 例EOC 组织标本中PURPL 的中位表达水平为0.525±0.006，设定PURPL 表达水平≥中位数为高表达、PURPL 表达水平＜中位数为低表达。分析各临床病理指标与PURPL 表达的关系显示，临床分期越晚、有淋巴结转移的EOC 组织中的PURPL 表达较高（表1）。

表1 EOC 组织中的PURPL 表达与临床病理指标的关系

2.4 Kaplan-Meier 生存分析

在65 例EOC 患者中，PURPL 高表达患者的OS和RFS 均短于PURPL 低表达患者（χ2=4.654，P=0.031 和χ2=5.878，P=0.015，图3）。

图3 EOC 组织中的PURPL 表达与患者生存率的关系

3 讨论

近年来，随着手术水平的不断提高、新型化疗药物的开发，EOC 临床治疗效果已经有了长足提高，尤其是靶向治疗和免疫治疗的出现，为复发和耐药EOC 患者的治疗提供了新的手段。但EOC 仍是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[5]，是威胁女性生殖健康的重要疾病之一，其发生发展的分子机制目前尚不十分清楚。

人类基因组的转录产物近98% 是非编码RNA，其中lncRNAs 是指长度＞200 个核苷酸片段的非编码RNA，其主要功能之一就是作为竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）靶向结合微小RNA（microRNAs，miRNAs），即作为miRNA 海绵，避免其下游靶基因的降解和功能抑制[6-7]。研究证实，lncRNAs 与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移关系密切，如结肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、EOC 等，可作为评估上述恶性肿瘤预后的分子标记物和潜在的临床治疗靶点[8-13]。

PURPL 又称LINC01021，主要通过破坏p53 稳定性、降低p53 水平，进而影响细胞周期进展和细胞生长，利用CRISPR/Cas9 技术抑制PURPL 表达，可使结肠癌细胞中抑癌基因p53 水平增加、细胞周期G1 期阻滞、细胞生长受限、动物体内移植瘤生长抑制[14]。另有研究显示，与癌旁的正常组织相比，肝癌组织中的PURPL 高表达，其表达水平与肿瘤分期和肿瘤大小呈正相关、与p53 mRNA 水平呈负相关，抑制细胞中的PURPL 表达可使肿瘤细胞生长受限、细胞周期进程阻滞和凋亡增加[15]。目前，PURPL 与EOC发生发展的关系尚不清楚。

由于PURPL 与人类恶性肿瘤关系的研究报道较少，本课题组首先采用开放医学数据库进行检索，初步分析PURPL 在不同人类恶性肿瘤组织及配对的正常组织中的表达情况，以初步明确PURPL 与恶性肿瘤发生发展的关系。经对多个医学数据库检索，lnc-RNASNP2 和GEPIA 数据库提示，PURPL 在包括EOC 组织在内的多种人类恶性肿瘤组织中的表达，均明显高于配对的正常组织。进一步对Kaplan-Meier Plotter 数据库检索显示，PURPL 高表达与EOC 患者RFS 和OS 缩短相关。为了验证上述数据库信息，本研究检测正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、早期EOC 组织和晚期EOC 组织中的PURPL 表达结果显示，与正常卵巢组织和良性上皮性卵巢肿瘤组织相比，EOC 组织中PURPL 表达明显升高，提示PURPL 异常高表达可能参与了EOC 的发生和进展。上述研究结论与既往胃癌、结肠癌、肝癌等有关PURPL 的研究报道结论一致[2,14-15]，提示PURPL 异常表达参与调控多种人类恶性肿瘤的发生发展。本研究进一步分析显示，晚期EOC 组织中的PURPL 相对表达量明显高于早期EOC 组织；临床分期越晚、有淋巴结转移的EOC 组织中的PURPL 表达越高；PURPL表达越高，患者的OS 和RFS 明显缩短。

综上所述，本研究通过数据库检索和组织样本检测，证实EOC 组织中存在PURPL 高表达，且与患者的预后不良相关，可作为卵巢癌预后监测的潜在标记物。并为深入研究EOC 细胞中的PURPL 靶向和调控下游miRNAs 及相关基因的分子机制提供了实验基础，在此基础上进一步研究血清PURPL 与CA125表达水平与EOC 治疗和预后监测的关系，有助于探寻新的EOC 治疗和预后监测的分子标记物。