肠道菌群和免疫检查点抑制剂治疗关系研究进展*

陈平 林建光 戴炀斌 赵爱月 戴毅君 综述 许天文 审校

近年来，以免疫检查点为药物靶点的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）成为治疗肿瘤的前景药物。大量研究证实了ICI在临床中的有效性，但仍有较多接受ICI治疗的患者未获益。提高免疫治疗的临床应答率，寻找免疫治疗生物标志物成为免疫治疗能否突破的当务之急。肠道菌群是近年来新兴的免疫生物标志物之一，本文旨在根据现有研究阐述肠道菌群如何影响机体免疫治疗，寻找提高ICI疗效的可能性。

1 肠道菌群和免疫治疗

2015年有研究报道，在小鼠模型中，肠道菌群对PD-1 类免疫治疗起决定性作用，无菌小鼠存在免疫缺陷，粪便移植和口服差异细菌可逆转这种缺陷［1-2］。随后3项同期研究［3-5］显示，在免疫治疗的前2个月和治疗后的1个月使用广谱抗生素，使体内细菌（包括肠道菌群）紊乱，导致总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression free survival，PFS）显著降低，这类结果同样可通过移植粪便逆转。将对PD-1疗效的患者粪便移植到抗生素小鼠模型上，能恢复小鼠重新获得ICI 免疫治疗的响应。上述研究还发现黑色素瘤患者肠道细菌的丰富度是影响免疫治疗反应的主要因素。不同的菌群对免疫疗法的影响存在差异，菌群分为“好菌群”和“坏菌群”。国内外研究得出的“好菌群”不尽相同，地域差别也是影响因素之一（表1）。

2 肠道菌群影响免疫治疗疗效的机制探索

2.1 肠道菌群通过影响免疫系统发育和调节决定ICI疗效

ICI 治疗的实质是解放免疫系统的“刹车“效应，微生物群通过影响机体免疫系统间接决定ICI疗效，是治疗过程中潜在的生理机制之一。如无菌小鼠的免疫系统极不发达［9］，缺乏有效的抗肿瘤适应性免疫和肿瘤坏死因子依赖性坏死反应，因此ICI难以在此类免疫沙漠型的对象中起作用［10］。

表1 不同肠道细菌对免疫治疗的影响

2.1.1 肠道菌群和局部黏膜反应 肠道微生物群与免疫系统的发育和调节密切相关，特别与局部黏膜免疫有关。研究证明，相比正常小鼠，无菌小鼠的肠道黏膜变薄，肠系膜淋巴结变小且缺乏生发中心，淋巴滤泡缺乏，异常的高内皮小静脉增生伴淋巴细胞结合不良［11-14］，这些因素导致无菌小鼠胃肠道黏膜免疫明显缺陷。这些局部免疫缺陷还伴随着CD4+淋巴细胞数量、浆细胞数量和IgA 生成的减少，导致肠道屏障功能进一步受损［15］。并且，这种缺陷的影响不局限在胃肠道，其进一步介导全身免疫机制异常，导致ICI治疗失效。

目前主要有两种理论解释局部免疫系统介导全身免疫机制。一种是肠道微生物通过多种蛋白质和（或）代谢物调节免疫反应。特定的肠道菌群可通过发酵在结肠中产生多种代谢物。如短链脂肪酸、色氨酸、维生素A、维生素B12等，其在促进原始T 细胞分化，影响肠淋巴滤泡发生，维持正常淋巴细胞数量和NK细胞活性中起重要作用，是全身免疫环境发育和免疫细胞启动的关键因素［16-19］。另外一种是共生细菌表达的抗原和肿瘤中发现的新表位之间的交叉反应［20］，这一机制尚待进一步探索，肠道菌群将有可能为肿瘤免疫治疗提供更多的杀伤靶点。

2.1.2 肠道菌群和系统固有反应 系统固有免疫调节也受共生微生物群的影响。循环的细菌衍生分子，如脂多糖、肽聚糖或鞭毛蛋白，当由先天性免疫细胞上的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRS）识别时，其可以通过信号传递促进MyD88 依赖的途径发出信号，增强全身先天免疫细胞的反应性［21］。Science评论性文章表明肠道微生物能通过局部侵犯而侵入器官并产生理想或不良的结果。细菌移位进入脾脏、淋巴结或肿瘤可能引发强烈的免疫反应，这或许有利于激活惰性的肿瘤免疫微环境，辅助ICI免疫治疗。另外，系统适应性免疫也受到共生细菌的刺激，特别是远处（非黏膜）淋巴组织的正常发育，如脾脏和外周淋巴结。有研究表明，无菌小鼠器官中B淋巴细胞滤泡和T淋巴细胞区发育不良，血清IgG水平较低，证实上述结论［22］。

综上所述，肠道菌群可通过影响机体局部和（或）全身的免疫发育和调节，建立宏观和（或）微观的免疫环境，最终成为影响肿瘤ICI治疗疗效的重要因素。

2.2 肠道菌群与免疫治疗生物标志物

随着逻辑生物标志物PD-1/PD-L1地位的下降，为了提高ICI 疗效，新兴的标志物被相继发掘，包括肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）、肿瘤特异性新抗原肽（tumor neoantigen burden，TNB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）、肿瘤浸润微环境、肠道菌群等。肠道菌群可能与其他标志物间存在联系。

2.2.1 肠道菌群和TMB、TNB TMB定义为肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变数量，一般以非同义突变总数量表示。许多小鼠或人类肿瘤免疫应答的靶点是TNB，这些新抗原肽是由肿瘤基因组的体细胞突变引起的，继而产生特异性T细胞反应。一项研究纳入64 例采用抗CTLA-4 抗体治疗的恶性黑色素瘤患者，结果表明，长期受益的患者相比对照组具有特异性的体细胞新表位［23］。一项包括27种肿瘤类型的荟萃分析显示平均反应率与TMB 呈正相关［24］。TMB 的实质是基因突变，突变基因产生的新生抗原在ICI治疗中强化了肿瘤免疫识别。

肠道菌群可以损伤DNA，在肿瘤的发生中起重要作用。虽然鲜见肠道菌群变化与TMB高低关系的直接研究，但根据其作用机制，可推断肠道菌群与TMB间存在联系。肠道微生物可通过直接或间接的方式损伤宿主DNA 或抑制其DNA 修复功能。产肠毒素脆弱类杆菌可激活Wnt/β-catenin 信号通路，从而引起肠上皮细胞DNA 损伤；PKS 阳性大肠埃希菌可编码基因毒素，导致肠上皮内DNA双链断裂，通过破损-融合-交联反应进一步导致染色体不稳定性下降；革兰阴性菌可以产生致死性肿胀毒素进入细胞核损伤DNA，同时阻碍修复过程；硫酸盐还原菌还原食物中的硫酸根离子产生硫化氢，引起人肠上皮细胞产生剂量依赖的氧化性DNA损伤和断裂。另外肠道细菌的代谢产物如次级胆汁酸、葡萄糖醛酸酶、亚硝基化合物等均有促进肠道炎症的作用，导致基因突变几率升高。理论上讲，更多的基因突变，使高TMB 及高TNB 的机会也极大增加，但需要更多研究证实。多种肿瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、血液肿瘤、黑色素瘤、泌尿系肿瘤中肠道菌群间存在差异，推测其机制：基本均存在炎症及细菌代谢产物在其中的影响作用，其TMB 高低差异或许可用不同的肠道细菌解释。

2.2.2 肠道菌群和MSI MSI-H 是指由于错配修复基因受损（mismatch repair，MMR）而导致的体细胞突变在其区域内的高积累率，MMR是一个负责DNA损伤识别和修复的系统。从机制上讲，MSI 肿瘤是高TMB 肿瘤的一种特殊类型，其由于高突变而产生大量新肽。2017年美国食品和药物管理局（FDA）批准的3 种免疫治疗方案均可用于转移性MSI-H 大肠癌患者。并且nivolumab 和pembrolizumab 适用于MSIH 的任何肿瘤，这是基于Keynote 016、Checkmate 142的试验结果，研究证实了15 种MSI 癌种对免疫治疗的高敏感性［25-26］。MSI 已成为广泛认可的免疫标志物。Tahara等［27］通过对149个结直肠癌组织、89个癌旁正常黏膜和72个来自无癌个体的结肠黏膜进行实时定量PCR，证实了癌组织中的细菌数量更多，表明高梭状芽胞杆菌与MSI 之间存在相关性（P=0.018），在可获得全外显子组测序数据的11 例病例中，2 例为高梭状芽胞杆菌的病例中具有最高的体细胞突变数量。这为肠道菌群与MSI 之间的关系提供了依据，同时再次提示了细菌与TMB 的可能联系。随后，在国外一项包括2 000余例的结直肠癌研究中证明了梭状芽胞杆菌（F.nucleatum）与MSI 的关联性，验证了上述结论［28］。

肠道菌群和TMB、TNB及MSI之间的潜在联系可能是影响ICI疗效的潜在机制之一，大量的肿瘤新生抗原肽有助于增强微生物抗原与肿瘤抗原之间的模拟或交叉反应。因此联合检测肠道菌群与TMB、MSI可能是未来提高ICI有效率的方向之一。

3 肠道菌群和免疫相关不良事件

虽然免疫治疗效果卓越，且不良反应通常比化疗小，但其同样可以发生严重的免疫相关不良事件（immune related adverse events，IRAEs），包括免疫相关性结肠炎、肝炎、间质性肺炎、甲状腺炎、垂体炎等。近期研究发现肠道菌群在出现免疫相关性结肠炎的患者中存在区别。Chaput 等［29］发现在抗CTLA-4治疗的转移性黑色素瘤患者队列中，在未发生结肠炎的患者中观察到高比例的类杆菌。同样的，Dubin等［6］研究表明接受抗CTLA-4治疗后发生结肠炎的类杆菌的数量明显低于无结肠炎患者，提示类杆菌属对ipilimumab 相关结肠炎具有保护作用。国内一项研究显示重症ICI 相关性结肠炎中乳酸杆菌的数量明显减少，口服罗伊氏乳酸杆菌（L.Reuteri）可预防性抑制结肠炎的发生和发展，改善ICI治疗引起的体重减轻和炎症状态［30］。通过肠道菌群干预IRAEs 的研究目前仍较少，进一步研究确定耐IRAEs患者的优势菌群是未来的研究方向。

4 肠道菌群干预疗法对免疫治疗的影响

目前，抗生素和粪便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是唯一经FDA批准的针对肠道微生物群的方法［31］。

4.1 抗生素

已经证实抗生素的使用可干预肠道菌群的组成成分，从而影响ICI疗效。如当给小鼠注射万古霉素时，CTLA-4 阻滞剂的效果增强［2］。但理论上抗生素的使用对ICI的影响尚存争议，因为无法用抗生素准确控制肠道的“好菌群”和“坏菌群”。Routy等［3］通过对非小细胞肺癌、肾癌和尿路上皮癌患者应用抗PD-1和PD-L1治疗的回顾性分析，发现治疗前2 个月或治疗后1 个月内使用抗生素的患者组无进展生存期和总生存期明显短于未接受抗生素治疗的相同肿瘤类型患者组。另有研究称抗生素的使用与抗PD-1和抗CTLA-4 治疗的荷瘤小鼠和转移性结肠癌和非小细胞肺癌患者的预后较差相关［2，32］。然而，一项接受ipilimumab 治疗的转移性黑色素瘤患者前瞻性队列和接受nivolumab治疗的晚期非小细胞肺癌患者回顾性队列研究表明，抗生素的使用对检查点阻断反应或潜在预测关联没有影响［29］。在多样性方面同样存在差异，与无应答者相比，对抗PD-1 治疗有应答的黑色素瘤患者的肠道微生物组群具有更高的多样性。一项单独的黑色素瘤队列研究发现，抗PD-1和抗CTLA-4 治疗的应答者和非应答者的肠道微生物多样性水平无显著性差异［33］。结论的矛盾在各种癌种中均有体现。一项约200例多中心队列研究表明，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤在内的多个癌种，在免疫治疗前1 个月接受过广谱抗生素治疗组与未使用抗生素组相比，总生存期减少13倍，而在免疫治疗期间使用似乎无影响［34］。如何使用抗生素、何时使用、使用何种抗生素，如何构建有利的肠道菌群环境成为免疫治疗未来研究的关键。

4.2 粪便微生物移植

FMT最早用在伪膜性肠炎治疗，逐渐扩展至难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、过敏性胃肠病等多种肠源性疾病，总体上短期安全性较高。目前报道的研究，多基于动物模型间、人类向动物的粪便移植，表明粪便移植在动物模型的ICI疗效干预上可行［1，5］，鲜见ICI患者间的粪便移植数据。FMT的有效性建立在整个肠道群落的替代基础上，是一种“激进”的干预措施，可能会导致不可预测的结果，包括感染、肠道炎症，免疫相关性疾病，并且在中国伦理学等问题尚面临争议。一项研究表明使用上消化道途径导致不良事件发生率高于下消化道途径（43.6%vs.17.7%）［35］。Imdad等［36］关于FMT疗效安全性的系统评价报道，由于FMT的严重不良事件发生率低，但证据质量低，缺乏可靠的数据，因此尚无明确的结论。目前，研究仍停留在ICI有效人群粪便向小鼠移植恢复小鼠免疫应答，精准确定最有利的ICI有关菌群尚需要更多的探索，这也是未来肠道菌群成为免疫治疗靶点的关键。

4.3 益生元、益生菌、合生元、后生素的使用

除了抗生素及粪便移植，口服益生元、益生菌、合生元及后生素是另一种干预肠道菌群的方法。益生元是不易消化的碳水化合物，通常包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和乳果糖，这些物质已被证明可增加健康人群中的共生乳酸杆菌和（或）双歧杆菌［37］。益生菌被定义为对人体有利的活体微生物。合生元是益生菌及益生元的组合。临床上广泛使用益生菌调节肠道菌群，治疗腹泻、便秘、腹胀、消化不良等胃肠道症状。在免疫治疗患者中，通过口服益生菌提高疗效同样需要准确的有利菌群理论的支持。有研究称口服双歧杆菌可增加CD8+肿瘤特异性T 细胞的肿瘤浸润和IFN-γ的产生，并通过一种涉及增加脾脏和肿瘤内树突状细胞活化的机制改善基础肿瘤控制和抗PD-L1的疗效［1］。另外，尽管大量的研究表明口服对应肠道细菌提高ICI疗效是成立的，但益生菌安全性的证据仍然不足。只有确定了各种临床条件下最有益的微生物群组成，才有可能将微生物群组成用作生物标记物、诊断工具或治疗靶点。后生素是细菌代谢的非活性产物（包括短链氨基酸、色氨酸、维生素等），以特定方式影响宿主的反应。

总的来说，干预肠道菌群进而调节免疫治疗疗效仍处于摸索阶段。

5 结语

肠道菌群是重要的ICI标志物，但相关研究结果存在较多差异，需要进一步探索。目前在动物体内将共生细菌物种与ICI的抗癌作用联系起来的机制尚不确定。进一步了解微生物群的免疫调节机制，标准化取样、测序技术和数据分析，确保研究设计的一致性，探索其与已知生物标志物间可能的潜在联系，是需要纳入未来研究的关键考虑因素。

值得注意的是人类应答者的粪便移植可以包含多种微生物，并且检查点抑制剂应答的机制可以是共同的。在未最终确定有利菌群的种类和数量前，益生菌等其他手段可能加重患者病情，干扰免疫治疗。因此，在进行相应研究时，涉及接种单系细菌和在应答者中进行免疫分析时应该更加谨慎。