PD-L1+巨噬细胞在肿瘤发生发展中的研究进展*

黎贵芸 边莉

癌症的发生发展既是多基因参与、多阶段逐渐形成所致，又是肿瘤细胞与其所处微环境的适应性过程。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由细胞外基质、血管、浸润的炎症细胞、多种相关的组织细胞和细胞因子、生长因子以及代谢物、微生物菌群等所形成的复杂网络［1］，其为肿瘤细胞赖以生存的“土壤”，为肿瘤细胞生长、播散提供必要条件，在这片“土壤”中，巨噬细胞为关键的参与者。

巨噬细胞为固有免疫的重要组成部分和适应性免疫启动的关键因子，不同组织中的巨噬细胞具有不同的功能，如小胶质细胞促进神经元存活、脾红髓巨噬细胞能够去除衰老的红细胞［2-3］。巨噬细胞可塑性极强，在特定的环境、不同的刺激因素下塑造出的特性、活化状态、表型和功能各不相同，主要分为抵御细菌感染、激活免疫、抑制肿瘤发生的经典活化型（M1）巨噬细胞，和化疗耐药、免疫抑制、促进肿瘤发展的交替活化型（M2）巨噬细胞，M1和M2型为巨噬细胞活化的两种极端表型［4］，也是传统的巨噬细胞分型方式。但是大部分实验中活化的巨噬细胞并不完全隶属于M1或M2，而是处于二者之间不断转化的状态［5］，鉴于M1、M2的复杂性，为了标准化实验流程，有研究建议巨噬细胞的分型应该包括3项原则：1）巨噬细胞的来源（人外周血单核细胞、小鼠骨髓、小鼠腹膜巨噬细胞等）；2）激活剂类型（M＜IL-4，interleukin-4＞，M＜Ig，immunoglobulins＞，M＜IL-10＞，M＜interferon-γ，IFN-γ＞，M＜lipopolysaccharide，LPS＞等）；3）巨噬细胞活化的标记［6］。

1 巨噬细胞的起源与自行更新

巨噬细胞主要由骨髓中的造血干细胞（hemato⁃poietic stem cells，HSCs）分化产生或胚胎时期卵黄囊（yolksac，YS）中祖细胞衍生而来［7-8］。目前，公认的研究确定巨噬细胞有3种不同的发育途径：1）组织驻留巨噬细胞（tissue resident macrophage，TRMs）：这群细胞主要包括卵黄囊或胎肝祖细胞衍生的巨噬细胞前体。胚胎巨噬细胞的起源分为两个阶段，在原肠胚早期（embryonic day 6.5-8.5，E6.5-8.5），从胚外中胚层的YS 出现第一种具有造血功能的前体细胞，启动早期造血功能，产生巨噬细胞及其他有核细胞，这一阶段称为早期造血阶段；之后红髓系祖细胞（erythromyeloid progenitor，EMP）在E8.5～E10.5 后迁移进入胎肝（fetal liver，FL），并在FL里分化为包括巨噬细胞在内的多种细胞［9］。中枢神经系统的小胶质细胞为胚胎巨噬细胞的典型代表，稳态条件下通过局部增殖实现自行更新并持续到成年期［10］；2）造血干细胞HSCs 来源的巨噬细胞：真皮、肠道、脾脏边缘的胚胎巨噬细胞在出生后迅速被HSCs 的单核细胞取代，并依赖单核细胞募集替代更新［11-13］；3）混合来源的巨噬细胞：有研究将CD45.1；Myb+/+小鼠的骨髓细胞移植到CD45.2；Myb-/-小鼠体内，发现受体小鼠外周组织巨噬细胞表达CD45.1，而肺、脾、肾中混有表达CD45.1 和CD45.2 的巨噬细胞，表明这些组织中的巨噬细胞群既有组织驻留的巨噬细胞，又有造血干细胞来源的巨噬细胞［14］。

2 肿瘤相关巨噬细胞

浸润到肿瘤中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs），与正常的巨噬细胞相比，TAMs 为一种倾向于免疫抑制表型、分化不完全的巨噬细胞。新近研究表明，在肿瘤中胚胎来源的巨噬细胞与单核细胞衍生的巨噬细胞可能具有不同的表型和功能［15-17］，通常认为TAMs 主要源自循环单核细胞，但肺癌和胰腺癌小鼠模型中发现高达50%的巨噬细胞为组织常驻巨噬细胞，在上述肿瘤中，HSCs 起源的TAMs 参与免疫抑制和抗原呈递，胚胎衍生的TAMs 负责组织重塑和伤口愈合。肿瘤微环境中的各类细胞因子对巨噬细胞的募集极其重要，CCL-2/CCR2、CCL-5/CCR5 等趋化因子轴可募集血液中的单核细胞/巨噬细胞到肿瘤区域，肿瘤细胞分泌的IL-10、巨噬细胞集落因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）等也可促进巨噬细胞向肿瘤部位迁移，另外，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）等也参与巨噬细胞的招募与转运［18］。癌细胞与巨噬细胞之间的互作通过多种细胞因子实现，肿瘤细胞招募大量的巨噬细胞到肿瘤部位，而TAMs又反过来分泌多种细胞因子维持肿瘤细胞增殖、重塑细胞外基质、诱导血管和淋巴管新生，为肿瘤的生长、侵袭和转移提供条件［19］。TAMs 通过表达分泌不同的调节分子如内皮细胞酪氨酸激酶-2（tyrosine kinase-2，Tie2），集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）构成肿瘤转移微环境来加速肿瘤细胞活化、肿瘤血管再生、肿瘤细胞侵袭和转移［20-22］。

3 肿瘤相关巨噬细胞中PD-L1的调节机制及其在肿瘤中的作用

程序性死亡受体-1配体（programmed death receptor-1 ligand，PD-L1）也称为B7-H1或CD274，属于B7家族的细胞表面糖蛋白。在生理条件下，组织细胞表达的PD-L1 与淋巴细胞表面的程序性死亡受体-1（pro⁃grammed death receptor-1，PD-1）结合使机体免受过度炎症反应造成的损害，同时也在自身免疫耐受及防治自身免疫性疾病中发挥重要作用［23］。当肿瘤发生时，高表达PD-L1的肿瘤细胞，抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放，诱导淋巴细胞凋亡，从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用，发生肿瘤免疫逃逸［24］。

PD-L1 介导的免疫抑制还受蛋白质糖基化和泛素化的广泛调控，多数细胞表达的PD-L1 具有高度糖基化的模式［25］，蛋白印迹实验可检测到33 kDa 的非糖基化PD-L1和45～55 kDa糖基化PD-L1，PD-L1蛋白胞外结构域T180 和S184 区域有糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）的磷酸化基序，非糖基化的PD-L1 在GSK3β 磷酸化作用后会被泛素/蛋白酶体系统降解［26］。PD-L1除了通过增加自身糖基化水平稳定自身蛋白外，还可以通过降低自身泛素化水平延长蛋白半衰期，肿瘤相关巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）触发核因子κB（nuclear factor κappa-B，NFκB）途径，诱导癌细胞表达去泛素化酶，抑制PD-L1的泛素化降解，从而增强PD-L1/PD-1相互作用以避开T 细胞免疫监视［25］。趋化素样因子MARVEL 跨膜结构域超家族-6（chemokine-like factor MARVEL transmembrane domain containing 6，CMTM6）蛋白可阻止PD-L1 与E3 泛素连接酶（STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1）产生泛素化来延长PD-L1 蛋白的半衰期，小鼠黑色素瘤模型中敲除CMTM6 会下调PD-L1 表达，增强肿瘤特异性T 细胞活性［27-28］。除了肿瘤细胞，肿瘤相关巨噬细胞也可高表达PD-L1，并通过不同的机制介导免疫调节。

高表达PD-L1 的TAMs 介导免疫调节主要通过与CD8+T 淋巴细胞上的PD-1 受体结合，募集并激活磷酸酶SHP2，引起下游蛋白激酶Syk 和PI3K 的去磷酸化，进而下调mTOR、AKT 和ERK2 等通路的信号，抑制效应T细胞的增殖、存活及IFN-γ和TNF-α的分泌，发挥负向调控T 细胞活性的作用，并介导其发生凋亡，导致杀伤肿瘤的淋巴细胞数量减少，削弱免疫系统的抗肿瘤效应［29］。

3.1 TAMs表达PD-L1的调控机制

在巨噬细胞表达PD-L1的调节机制中，细胞因子、趋化因子的诱导和维持作用最重要，见图1。有研究通过体外培养腹腔巨噬细胞，模拟富含巨噬细胞的肿瘤微环境。研究发现，活化T细胞分泌的INF-γ介导巨噬细胞高表达PD-L1，阻断INF-γ后PD-L1的表达下调［30］。淋巴瘤细胞分泌的可溶性因子IL-27B（EBI3）激活Stat3途径调控TAMs表达PD-L1，而TAMs衍生的IL-27p28与淋巴瘤衍生的IL-27形成异二聚体IL-27，也能够参与调控PD-L1的表达［31］。脑胶质瘤细胞自分泌/旁分泌IL-10，激活Akt/PI3K信号通路，上调单核巨噬细胞表达PD-L1［32］。肿瘤细胞分泌的CSF-2可诱导巨噬细胞分泌CXCL8，CXCL8进而上调巨噬细胞表达PD-L1［33］。分泌性磷蛋白（secreted phosphoprotein 1，SSP1）也是调控TAMs中PD-L1表达的重要因子，抑制SPP1的表达，则下调M2 型巨噬细胞PD-L1、IL-10 和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）的表达［34］。巨噬细胞PD-L1的表达还可通过自身COX2/mPGES1/PGE2通路调节［35］。

图1 肿瘤微环境中TAMs表达PD-L1的调控机制

巨噬细胞表达PD-L1除了受特定细胞因子的调节外，还受内源性致癌途径的调控。有研究在白血病、肝细胞癌Tet-off 转基因小鼠模型中发现，抑制myc 基因表达，可导致巨噬细胞PD-L1 蛋白水平降低，体外实验研究发现myc通过与编码PD-L1基因的启动子区域结合而直接调控PD-L1 的基因表达［36］。自噬（autophagy）、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等在巨噬细胞表达PD-L1的调控作用中也发挥重要作用。肿瘤细胞释放的自噬体TRAP 诱导巨噬细胞向M2型转变，并通过TLR4-MyD88-p38-STAT3信号通路上调肿瘤相关巨噬细胞PD-L1 和IL-10 的表达，抑制T 细胞增殖、促进肿瘤生长［37］。有研究通过染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因检测发现缺氧诱导因子HIF-1α 与PD-L1 近端启动子中的乏氧反应元件HRE 直接结合，选择性上调巨噬细胞PDL1 的表达，在缺氧条件下阻断PD-L1 的表达可下调巨噬细胞表达IL-6 和IL-10，阻断巨噬细胞介导的T细胞活化作用［38］。ROS则可通过转录因子NF-κB介导巨噬细胞上调PD-L1 的表达［39］。除此之外，有研究通过对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、肾细胞癌、黑色素瘤行免疫组织化学染色发现，程序性死亡受体-2配体（programmed death recep⁃tor-2 ligand，PD-L2）蛋白与PD-L1 蛋白存在明显的位置相关性，并且与其他细胞因子上调PD-L1一致，PD-L2 也驱动调节PD-L1 的表达［40］。而在BRCA1/P53缺失的乳腺癌小鼠模型中，紫杉醇治疗可诱导体内肿瘤相关巨噬细胞表达PD-L1，导致出现免疫抑制性肿瘤微环境［39］。

3.2 PD-L1+的TAMs与肿瘤的关系

TAMs的存在通常与实体瘤的不良预后相关。有研究证实，TAMs表达PD-L1后肿瘤微环境处于免疫抑制状态。肿瘤基质细胞中的PD-L1表达为总体生存期的独立预测因子。胆管细胞癌中，PD-L1阳性病例中巨噬细胞的数量显著高于PD-L1阴性，并且PD-L1阳性的患者总生存期比PD-L1阴性的患者差［41］。在肝细胞癌中大量PD-L1+巨噬细胞的浸润与患者总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease frss survial，DFS）呈负相关，肿瘤周围基质中巨噬细胞的密度与肿瘤大小、肿瘤多样性和淋巴结转移相关［42］。有研究在113例Ⅰ期NSCLC中发现，肿瘤细胞和巨噬细胞低表达PD-L1的患者5年OS为94%，显著高于肿瘤细胞和巨噬细胞高表达PD-L1的患者（OS为20%）［43］。

但PD-L1+的TAMs 与肿瘤的关系仍存争议。肝细胞癌中PD-L1+巨噬细胞的浸润密度与OS 和无复发生存期（relapse-free survival，RFS）呈正相关，PDL1+巨噬细胞浸润的肿瘤中CD8+T 细胞密度显著升高，免疫应答相关基因IFNG、GZMB 和PRF1 表达也升高［44］，说明PD-L1+巨噬细胞在肿瘤中表现出免疫活化的状态，对患者的预后具有保护作用。在原发性睾丸淋巴瘤中PD-L1+CD68+的巨噬细胞可作为独立预后因素［45］。有研究发现，PD-L1阳性的胃癌样本中具有M2 样表型（CD163+）的巨噬细胞的密度显著高于PD-L1 阴性的样本，其阳性表达密度虽与患者年龄、性别、肿瘤大小、Lauren分型和肿瘤分期等临床参数无明显相关性，但可作为一个潜在靶向治疗的指标［46］。研究证实，肿瘤中浸润的PD-L1+巨噬细胞还与抗PD-L1 抗体的疗效相关。有研究在近500 例NSCLC 中发现，80%的CD68+巨噬细胞表达PD-L1，在抗PD-1/PD-L1治疗时，这部分患者有更长的OS［47］。

3.3 PD-L1免疫组织化学定量检测标准

肿瘤中巨噬细胞PD-L1 免疫组织化学（immuno⁃histochemistry，IHC）染色评分与抗PD-1/PD-L1的疗效相关，既往临床研究表明，NSCLC中浸润的巨噬细胞PDL1 IHC结果呈3分（阳性细胞%＜1%为0分，1%≤阳性细胞%＜5%为1分，5%≤阳性细胞%＜10%为2分，≥10%为3分）的患者对抗PD-L1抗体MPDL3280A治疗反应明显，仅17%患者疾病进展，而肿瘤细胞PD-L1免疫组织化学染色结果呈3分的NSCLC患者中有38%患者疾病进展恶化［48］。Powles等［49］在205例转移性尿路上皮癌的研究中也发现，患者对抗PD-L1抗体MPDL3280A的治疗效果与肿瘤浸润性巨噬细胞PD-L1的IHC评分相关，但与肿瘤细胞IHC评分无关。

目前，中性福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）的PD-L1 IHC评分为确认患者是否接受抗PD-1/PD-L1治疗的唯一依据，但现阶段采用的评分方法、取用的临界值因PD-L1抗体克隆号、肿瘤类型和抗PD-1/PD-L1药物的不同而不同。结合文献及相关资料，现有详细判读细则的检测抗体有Dako 22C3和VENTANA SP142、SP263，见表1。Dako 22C3检测试剂盒仅对肿瘤细胞PD-L1染色进行判读，VENTANA SP142和SP263检测试剂的判读包含肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞PD-L1染色的判读（表1数据来自下述官网：1）https：//www.agilent.com；2）http：//reagent-catalog.roche.com；3）http：//reagent-catalog.roche.com）。

表1 PD-L1免疫组织化学判读

4 结语

TAMs 作为肿瘤微环境中重要的组成成分，在肿瘤的发生、发展和侵袭转移过程中发挥重要作用。在临床研究中，巨噬细胞已成为当前肿瘤治疗的热点，却因其复杂的机制网络，尚不能灵活运用。PDL1+的巨噬细胞在临床研究中尚存争议，这可能与TAMs 表型不同有关。因此，通过分析不同起源、不同表型的TAMs在肿瘤中发挥的作用以及更新机制，为寻找抗肿瘤治疗的精准靶点提供理论依据。