PD-1/PD-Ls在EBV阳性T/NK淋巴组织增殖性疾病中的表达及临床意义*

胡俊霞 陈清江 张旭东 李文才 王冠男 王欣 董萌 吴少璇 马咪静 尹美凤杨万秋 丁梦杰 张明智 朱利楠

EBV阳性T/NK淋巴组织增殖性疾病［Epstein-Barr virus-positive T/natural killer（NK）-cell lymphoprolif⁃erative disease，EBV（+）-T/NK-LPD］是指 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的一组淋巴组织疾病，Ohshima等［1］根据细胞形态和克隆性可分为Ⅰ级反应期（多形性和多克隆）、Ⅱ级交界期（多形性和单克隆）和Ⅲ级肿瘤期（单形性和单克隆），共同构成连续的疾病谱系。EBV（+）-LPD分为B细胞型和T/NK细胞型，B细胞型可分为：淋巴样肉芽肿、慢性活动性EBV感染（chronic active Epstein-Barr virus infections CAEBV）-B细胞型、EBV（+）B细胞-LPD等；T/NK细胞型可分为：CAEBV-T/NK细胞型、种痘样水疱病（hydroa vaccin⁃iforme-like disease HVD）、蚊叮超敏反应（hypersensitivity to mosquito bites，HMB）等［2］。程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）为CD28共刺激受体超家族成员，参与外周耐受的诱导和维持，并在自身免疫、移植免疫、感染性免疫和肿瘤免疫的调节中起关键作用［3］，而程序性细胞死亡蛋白-1配体（programmed death-ligand 1，PD-L1）（B7-H1/CD274）和程序性细胞死亡蛋白-2配体（programmed death-ligand 2，PD-L2）（B7-DC/CD273）为B7家族共刺激分子重要成员，研究发现其通过与其受体PD-1互相作用，传递负性调控信号诱导肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和免疫无能，促使肿瘤的免疫逃逸［4-6］。目前，PD-1、PD-L1和PD-L2在淋巴瘤等恶性肿瘤中的机制研究较多，但在EBV（+）-T/NK-LPD疾病（谱）中的研究较少。因此，本研究针对17例不同分级和类型的EBV（+）-T/NK-LPD患者标本进行PD-1、PD-L1和PD-L2检测并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集郑州大学第一附属医院2013年1月至2017年12月诊断为EBV（+）-T/NK-LPD石蜡包埋组织17例。其中，男性12例，女性5例，年龄10～82岁，平均年龄29岁；Ⅰ级4例，Ⅱ级7例，Ⅲ级3例，种痘水疱病样淋巴组织增殖性疾病3例。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人PD-1单克隆抗体、免疫组织化学SP染色试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人PD-L1多克隆抗体、兔抗人PD-L2多克隆抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学SP法检测PD-1、PD-L1和PDL2蛋白表达 石蜡包埋组织切片，常规脱蜡，置于0.01 mmoL/L pH6.0的柠檬酸盐95℃高压锅15 min抗原修复，待自然冷却至室温后PBS冲洗3次、暴露抗原、H2O2处理，兔抗人PD-L1多克隆抗体（1：120稀释）、抗PD-1单克隆抗体（1：100稀释）及抗PD-L2多克隆抗体（1：150稀释）4℃孵育过夜，PBS代替一抗作阴性对照；二抗孵育30 min后DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、透明，最后中性树胶封片。

1.2.2 免疫组织化学结果判断标准 所有免疫组织化学阳性结果均呈显著棕黄色，PD-1、PD-L1和PD-L2阳性物定位于细胞膜和细胞质中，均在高倍镜下随机选择5个视野计数阳性细胞数，每个视野至少计数200个细胞。参照肿瘤组织中PD-1、PD-L1和PD-L2表达的计数方法，结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性病例。肿瘤组织中PD-L1和PD-L2阳性细胞染色强度分级：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；5个视野阳性细胞平均百分数作为该例阳性细胞百分比，将其分级：＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。两项结果相乘得分≥2分为阳性，＜2分为阴性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。表达率比较采用Fisher确切概率法，等级资料采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1、PD-Ls表达与预后之间的关系

经Fisher确切概率法分析，PD-1、PD-L2的表达与预后无显著相关性（均P＞0.05，表1），PD-L1表达与预后呈正相关（P＜0.05）。

2.2 Spearman秩相关分析PD-1、PD-Ls与病理分级之间的相关性

结果显示PD-1、PD-L1和PD-L2的相关系数分别为r=0.141（P＞0.05）、r=-0.563（P＜0.05）和r=-0.149（P＞0.05），提示PD-1与PD-L2表达与病理分级之间无显著相关性，而PD-L1的表达与病理分级之间呈负相关，PD-L1的表达与病理分级之间的相关关系具有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.3 PD-L1和PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD组织中阳性表达与临床病理学的特征关系

本研究对17例EBV（+）-T/NK-LPD病理组织标本检测PD-Ls表达情况，考虑到EBV（+）-T/NK-LPD仍来源于淋巴细胞组织。因此，对PD-1在本疾病中的表达情况进行检测。结果显示，在17例组织标本中，PD-1表达阳性12例（图1），PD-L1表达阳性6例（图2），PD-L2表达阳性5例（图3）。PD-L1和PD-L2的表达与年龄、性别、LDH水平及Ki-67的表达水平之间无显著相关性（P＞0.05，表3）。

表1 PD-1、PD-L1和PD-L2的表达与预后之间的关系

表2 PD-1、PD-L1和PD-L2的表达与病理分级之间的相关性

图1 PD-1在EBV（+）-T/NK-LPD中阳性表达（SP法×200）

图2 PD-L1在EBV（+）-T/NK-LPD中阳性表达（SP法×200）

图3 PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD中阳性表达（SP法×200）

表3 PD-L1、PD-L2表达与临床病理特征之间的关系

3 讨论

EBV属于人疱疹病毒γ亚科的DNA病毒，1964年由Epstein和Barr首次在Burkitt淋巴瘤细胞株中发现，与多种人类恶性肿瘤有关［7］。EBV为一种在全球范围内广泛感染的疱疹病毒，人群中感染率在90%以上，呈潜伏感染状态并持续终生［8］。EBV具有嗜淋巴细胞和上皮细胞的特性，主要感染B淋巴细胞或鼻咽部的上皮细胞，亦可感染T细胞、自然杀伤细胞，引起的疾病主要包括鼻咽癌及EBV阳性的淋巴组织疾病，后者疾病中包括性质涵盖良性、交界性、肿瘤性的EBV（+）-T/NK-LPD，如种痘样水泡病样EBV（+）NK/T细胞淋巴组织增殖性疾病（HV-NK/T-LPD）、蚊虫叮咬超敏性EBV（+）NK/T细胞淋巴组织增殖性疾病［MBH-EBV（+）NK/T-LPD］等［9］。慢性活动性EB病毒感染（chronic active Epstein-Barr virus infections，CAEBV）是指持续超过6个月并且非免疫缺陷患者中的慢性活动性EBV感染相关的严重进行性淋巴组织增生性疾病［10］。2008年将此名词更正为“EBV（+）-LPD”。根据主要病变细胞成分不同分为B细胞型［EBV（+）B-LPD］、T/NK细胞型［EBV（+）-T/NKLPD］两种类型。在中亚/南美洲和墨西哥的东亚人和美洲原住民中，EBV感染的T细胞和NK细胞的克隆扩增和转化是主要的致病表现，而在少数西方患者中，EBV感染的B细胞扩增是EBV（+）-LPD的主要特征［11］。

PD-1为CD28共刺激受体超家族成员，主要在活化的CD4、CD8T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤（NK）细胞和树突细胞（DC）上表达［12-15］。PD-L1和PD-L2为PD-1的配体，两者虽同属B7家族，但具有不同的表达模式：PD-L1可在造血细胞、非造血细胞及肿瘤和肿瘤微环境中广泛诱导［16］；而PD-L2仅在少数细胞类型，如APC和Th2细胞上表达［17］。PD-1及其配体PD-L1/PD-L2是一组负性共刺激分子，其相互作用抑制T细胞受体（T-cell receptor，TCR）介导的抗原受体信号传导，包括T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性等，在诱导和维持外周耐受以及维持T细胞的稳定性及完整性方面具有重要作用。另外，也可以抑制癌细胞的T效应细胞增殖与功能，从而对抗病毒和抗肿瘤免疫具有不利影响［18］。同时，该通路的激活可使肿瘤局部微环境发生改变，T细胞免疫效应降低，从而介导肿瘤发生免疫逃逸，促进肿瘤生长［19］。经研究证实，包括尿路上皮肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和血液系统恶性肿瘤等多种肿瘤中存在PD-1/PD-Ls抑制通路参与，从而逃避免疫监视；研究发现血液系统恶性肿瘤高表达PD-L1，并且PDL2在较小程度上表达，与不良预后相关［3］。NK/T细胞淋巴瘤、部分弥漫大B细胞淋巴瘤等多种淋巴瘤的发生、发展均与EBV密切相关［20］，EBV编码的潜伏膜蛋白-1（latent membrane protein-1，LMP-1）的表达促进AP1和JAK-STAT信号通路激活，导致PD-L1在上述疾病中均高表达［21］。Chen等［22］研究发现，PD-L1在经典的霍奇金淋巴瘤、结外NK/T淋巴瘤中的表达均＞80%，在EBV阳性鼻咽癌中表达高达90%，在EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤中达100%。因此，在EBV阳性的淋巴瘤中PD-L1呈显著的高表达状态。EBV（+）-T/NK-LPD为一组淋巴组织增殖性疾病谱，随着疾病进展可由良性病变转变成为肿瘤性病变，肿瘤期相当于进展为淋巴瘤或白血病［23］。PD-L1、PD-L2在EBV（+）-T/NK-LPD疾病谱中的表达与临床病理学特征及病理分级是否相关，目前尚未明确。

本研究对17例EBV（+）-T/NK-LPD病理组织标本检测PD-Ls表达情况，考虑到EBV（+）-T/NK-LPD仍来源于淋巴细胞组织。结果显示在17例组织标本中，PD-1表达阳性12例，PD-L1表达阳性6例，PDL2表达阳性5例。PD-1、PD-L2表达与预后无显著相关性（P＞0.05），PD-L1表达与预后呈正相关（P＜0.05）。PD-L1、PD-L2的表达与年龄、性别、LDH水平及Ki-67的表达水平之间无显著相关性（P＞0.05）。PD-1与PD-L2的表达与病理分级之间无显著相关性（r=0.141，-0.149，均P＞0.05），而PD-L1的表达与病理分级之间呈负相关（r=-0.563），PD-L1的表达与病理分级之间的相关关系具有统计学意义（P＜0.05）。本研究结果提示虽然PD-1的表达与预后、病理分级之间无显著相关性，但在EBV（+）-T/NK-LPD中高表达，PD-1/PD-Ls信号通路抑制剂可能成为该疾病谱的新治疗方案。然而，有研究表明［24-25］，如肺、消化道肿瘤，PD-1/PD-Ls信号通路抑制剂疗效与肿瘤组织PD-1、PD-Ls的表达无关。

综上所述，PD-L1的表达与预后呈正相关，提示生存患者的PD-L1表达率高于死亡患者；PD-L1的表达与病理分级之间呈负相关，随着病理分级的增高，PD-L1的表达反而降低。由于本研究病例数较少，结果可能存在偏差。因此，本研究结果仅为临床治疗提供理论依据，今后亟需进一步扩大样本进行PD-L1、PD-L2表达检测以及临床应用PD-1抗体的研究，从而明确PD-1/PD-Ls信号通路抑制剂对EBV（+）-T/NK-LPD的疗效。