放疗联合免疫治疗的生物学基础及研究进展*

尹利梅 庞琛 卢铀

·国家基金研究进展综述·

放疗联合免疫治疗的生物学基础及研究进展*

尹利梅 庞琛 卢铀

研究发现放疗能促进肿瘤细胞免疫原性死亡，并经肿瘤抗原呈递和特异性T细胞免疫应答过程来杀伤肿瘤，甚至产生系统性抗肿瘤免疫反应，引起照射野外肿瘤缩小，上述现象被称为放疗远位效应。尽管放疗的临床远位效应已有报道，许多基础及转化性研究也证实其发生存在一定的生物学基础，但放疗远位效应更多地表现为亚临床效应，难以达到临床客观疗效。目前，抗PD-1/PD-L1抗体免疫治疗在临床肿瘤研究中展示出明显而确切的疗效，是临床中局部放疗联合免疫治疗的新治疗模式。但是，这种新治疗模式的临床实践，应当基于能够产生远位效应的放疗分割模式以及最佳的联合时机，最终达到全身抗肿瘤免疫反应的协同疗效。

肿瘤 放射治疗 免疫治疗 远位效应

传统观点认为，放射治疗是一种标准局部治疗方式，主要通过对局部肿瘤细胞直接造成DNA损伤发挥抗肿瘤作用；同时，由于免疫细胞对放疗的固有敏感性，放疗也被认为是一种免疫抑制的手段［1］。有研究发现，放射治疗也能引起照射野外肿瘤组织的减小或消退，这种现象被称为远位效应［2］。近年来研究表明，局部放疗能够促进肿瘤相关抗原释放、上调主要组织相容性复合物Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）表达及招募免疫细胞，促进机体抗肿瘤免疫反应，与免疫治疗相结合具有协同作用［3-4］。

在临床实践中，远位效应的发生多见于病例报告，涉及多种肿瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌等［5-7］。本文就放疗远位效应的产生机制和研究进展，重点分析放疗联合免疫治疗的可行性及应用前景。

1 远位效应的产生机制与放射治疗的免疫效应

肿瘤通过多种机制来逃避机体的免疫监视，包括：下调肿瘤抗原及MHCⅠ分子的表达、分泌免疫负性因子如转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）、招募免疫抑制性细胞如调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）和骨髓来源的抑制细胞（my-eloid-derived suppressor cell，MDSC）等，而放疗可以打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。当机体的免疫活性效应超过免疫抑制效应并占据主导地位，远位效应才有可能产生［8］。

研究表明，放疗可以诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、暴露肿瘤抗原以成为“原位瘤苗”［9］，并诱导产生损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）以促进树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟。DAMPs主要包括钙网蛋白、高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等［3］。放疗促进肿瘤细胞钙网蛋白向细胞膜的转位，发挥“吞噬我”信号的作用，募集DC识别和处理肿瘤抗原［10］。HMGB1和ATP是放疗后死亡的肿瘤细胞释放的炎性分子，分别与toll样受体4、嘌呤受体P2X7结合后促进DC成熟［11］。

DC成熟后表型发生改变并向局部引流淋巴结迁移，将肿瘤抗原通过MHCⅠ途径呈递给CD8+T细胞，使之致敏活化后成为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［12］。这些肿瘤特异性CTL进入血液循环并归巢于肿瘤，可以特异性地识别所有表达相似抗原的细胞，并通过穿孔素、颗粒酶等途径介导靶细胞死亡，进而清除放疗野内和放疗野外肿瘤，远位效应由此产生［1］。

2 放疗联合免疫调节剂

虽然放疗可诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，但单独放疗时这一效应并不显著，尤其对于免疫原性较弱的肿瘤而言。因此，免疫调节剂联合放疗可以调节与放大远位效应［4］。

2.1 靶向DC

放疗可以促进DC对肿瘤抗原的呈递，靶向DC的免疫调节剂可放大此效应，从而促进远位效应的产生。Fms样酪氨酸激酶受体3配体（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand，Flt3-L）和粒细胞单核细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）均是促进DC生长和成熟的因子［3］。Chakravarty等［13］建立了小鼠自发性肺转移模型，并对原发肿瘤进行局部放疗（60 Gy×1次）联合Flt3-L治疗，结果提示原发肿瘤及肺转移灶的生长均受到抑制。而在免疫原性较差的小鼠乳腺癌模型中，这种联合治疗同样使远位瘤灶生长延缓［14］。在一项关于转移性癌症患者开展的临床试验（Clinical-Trails.gov：NCT02474186）［15］中，放疗（3.5 Gy×10次）联合GM-CSF治疗在22%非小细胞肺癌、36%乳腺癌患者中出现的远位效应。

2.2 靶向细胞毒性T细胞相关抗原-4（cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4，CTLA-

CTLA-4是表达在T细胞上的免疫检查点之一，与B7分子结合后诱导T细胞无反应性。因此，联合放疗与CTLA-4抑制剂有助于改善肿瘤微环境的免疫抑制进而引起远位效应。在小鼠自发性肺转移瘤模型中，联用放疗和CTLA-4抑制剂明显抑制了肺转移并延长了小鼠总生存期［16］。相似结果也出现在小鼠乳腺癌和结肠癌模型中［17］。进一步研究发现，在小鼠双腿皮下移植瘤模型中，局部放疗会引起双腿肿瘤Treg和CTL浸润增加。但当联用CTLA-4抑制剂后，肿瘤内Treg/CTL比值明显下降，炎症因子释放增加，最终引起远位肿瘤生长抑制［18］。临床实践中的个案报道也证实这种联合治疗可以引起临床远位效应［5-6］：1例转移性黑色素瘤患者在给予伊匹单抗（CTLA-4抑制剂）过程中评效为疾病进展，给予脊髓转移灶放疗后继续给予伊匹单抗治疗，发现所有病灶均明显缩小。监测患者血液学指标，发现其抗原呈递细胞数量较前明显升高，而MDSC较前降低，提示联合治疗产生了系统性抗肿瘤免疫反应。

2.3 靶向程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1，PD-1）通路

表达在T细胞上的PD-1与其配体PD-L1结合后可诱导活化的T细胞失活，进而抑制抗肿瘤免疫。目前，PD-1通路是肿瘤免疫治疗的常用靶点之一［4］。由于放疗会促进PD-L1的表达，因此放疗与抗PD-1/PD-L1治疗的联合具有实践基础［19］。在PD-1基因敲除的小鼠黑色素瘤和肾细胞癌模型中，局部放疗（15 Gy×1次）可产生明显的远位效应，并延长小鼠生存［20］。Victor等［21］研究发现，放疗联合CTLA-4抑制剂治疗肿瘤患者及荷瘤小鼠，可引起放疗和非放疗部位肿瘤的消退，但易复发。在这些复发的患者及动物模型中，PD-L1基因的表达高度上调，并构成一个“抗性基因标记”。联合放疗、CTLA-4抑制剂和PD-1通路抑制剂的“三重威胁疗法”，可恢复对放疗及CTLA-4抑制剂治疗的反应。

2.4 靶向TGF-β

作为一种强大的免疫抑制性细胞因子，TGF-β被认为是抑制远位效应产生的关键介质之一。放疗促进肿瘤微环境内TGF-β的释放，而TGF-β会抑制DC活化、CTL增殖及其功能［22］。在小鼠自发性肺转移模型和双腿移植瘤模型中，Vanpouille-Box等［23］发现放疗联用TGF-β抑制剂可产生远位效应，这可能与TGF-β被抑制后促进DC激活继而增强T细胞对肿瘤特异性抗原的免疫应答有关。

3 放疗的剂量与分割方式影响远位效应的产生

临床实践中，广泛采用1.8～2.0 Gy/次/d，每周5次的常规分割放疗（conventional fractionation radiotherapy，CFRT）。但由于免疫细胞对放疗非常敏感，反复多次放疗足以杀灭体内产生的免疫效应细胞［24］。Yovino等［25］研究发现，对脑部肿瘤2 Gy单次局部放疗即可导致5%的循环细胞受到0.5 Gy的剂量辐射，而当30次放疗完成后，99%的循环细胞接受了不低于0.5 Gy的剂量辐射。

立体定向消融放疗（stereotactic ablative radiotherapy，SABR）是指单次大剂量（≥5 Gy）、低分割（1～5次）的放疗方式，其生存率和局部肿瘤控制率与手术治疗相近［26］。较CFRT而言，SABR可引起更多的肿瘤细胞免疫原性死亡，促进肿瘤抗原释放及呈递［27］，从而引起更强的系统性抗肿瘤免疫效应。实验研究发现［28］，在相同生物等效剂量下，与36 Gy/9 f相比，23 Gy/2 f减少了MDSC，降低了血管内皮生长因子浓度，增强了PD-L1的抗肿瘤效应。目前，许多研究认为，SABR联合免疫治疗，无论是对于局部肿瘤的控制还是远位效应的产生，都更具有理论基础与应用前景。Bernstein等［29］结合临床与基础研究首次提出了免疫治疗联合SABR（首次命名为“ISABR”）的治疗策略。虽然如此，产生远位效应的较佳剂量分割方式仍存在争议。

Dewan等［17］利用动物乳腺癌和结肠癌模型，将放疗与CTLA-4抑制剂联用，并比较了20 Gy×1次、8 Gy×3次、6 Gy×5次3种放疗模式，发现仅后两种放疗模式可引起远位效应。而在小鼠肺癌和纤维肉瘤中，10 Gy×5次与2 Gy×12次均能产生远位效应，但前者更为明显［30］。到目前为止还未见超分割放疗引起远位效应的报道。

4 远位效应的争议性问题

4.1 肿瘤特异性

多数研究认为远位效应具有肿瘤特异性。Demaria等［14］研究发现，在小鼠乳腺癌（67NR）模型中，对其中一侧肿瘤进行放疗（6 Gy×1次）联合Flt3-L治疗，在引起局部肿瘤消退的同时，还观察到对侧肿瘤生长的延缓。但当非放疗部位肿瘤为不相关的小鼠B淋巴细胞瘤（A20）时，非放疗侧肿瘤生长却不受限制［14］。这在另外两项研究［17，20］中也得到了类似的结论，提示放疗诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡及特异性免疫细胞的激活对于远位效应的产生是必须的。

但是，根据Camphausen等［30］报道，小鼠背部接种Lewis肺癌或纤维肉瘤后对其腿部（无肿瘤部位）进行放疗（10 Gy×5次），结果背部肿瘤生长延缓，表明在这个研究模型中，对正常组织进行辐照也可以产生系统性免疫反应，而远位效应的产生可能与放疗后局部组织炎症反应释放细胞因子以及抗血管生成因子进入循环有关。

4.2 放疗对远位肿瘤的负效应

放疗会引起机体一系列复杂的反应，可表现为免疫促进作用，也可出现免疫抑制现象，这可能与放疗的剂量及分割方式、肿瘤的组织学类型、肿瘤微环境的免疫状态等有关。尽管许多研究证实了远位效应的存在，但在一些动物模型和临床报道中，局部放疗也会促进远处转移瘤的生长［31-32］。上述现象可能与放疗动员肿瘤细胞进入外周循环有关，其机制包括：放疗对局部组织和血管造成损伤，促进TGF-β的表达使肿瘤上皮细胞间质转化，进而促进肿瘤的侵袭和转移［33］。Martin 等［31］研究认为，当放疗剂量较低、不足以较好地控制局部肿瘤时，肿瘤细胞及其内容物更易进入循环导致转移瘤的产生和生长。

4.3 放疗联合免疫治疗的不良反应

尽管放疗联合免疫治疗展现出了较好地应用前景，但其临床治疗时的不良反应不可忽略。单用免疫调节剂即有可能引起较严重的不良反应，包括伴有横纹肌溶解症状的爆发性心肌炎［34］、以间质性肺炎为主的免疫治疗相关性肺炎［35］等；而当免疫调节剂联合放疗时，则具有加重放疗引起的放射性肺损伤的可能性：近期研究发现，PD-1抑制剂联合放疗可促进放射性肺炎的发生，其可能与CD8+T淋巴细胞增多有关，且可能增加放疗相关死亡事件的发生概率［36］。

5 结语

由于抗肿瘤免疫反应通常由刺激信号和抑制信号共同调节。因此，只有在合适的时间点进行合适的免疫调节才能促进远位效应的产生。目前，证据显示，大剂量分割放疗与远位效应的产生存在更为密切的联系。但是，因免疫反应的复杂性以及实验动物模型的局限性，有关放疗联合免疫治疗的转化性研究结果，还需临床验证探讨。同时，临床开展大剂量放疗联合PD-1抑制剂等免疫治疗的模式，以及这种联合治疗可能带来的潜在不良反应等问题有待于深入研究。

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Biological foundation and research progress on radiotherapy combined with immunotherapy

Limei YIN,Chen PANG,You LU

Department of Thoracic Oncology,West China Hospital,West China School of Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China

You LU;E-mail:radyoulu@hotmail.com

Numerous studies revealed that radiation can promote the immunogenic cell death,enhance the immune response of tumor-antigen-specific T cells,and induce systematic antitumor immunity,which may result in abscopal effect.Abscopal effect refers to the regression of non-irradiated metastatic lesions distant from the primary tumor site that is directly subjected to irradiation.Despite that abscopal effect has been clinically reported and that many preclinical studies have confirmed its biological basis,abscopal effect remains a subclinical phenomenon,in which objective efficacy is difficult to obtain.Currently,the anti-PD-1/PD-L1 therapy in clinical applications shows a clear and definite curative effect,thereby making local radiotherapy combined with immunotherapy a new treatment pattern.However,the clinical practice of this new mode should be based on appropriate dose and fraction and the most suitable temporal combination to achieve the synergic antitumor immune response.

tumor,radiotherapy,immunotherapy,abscopal effect

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.296

四川大学华西医院胸部肿瘤科（成都市610041）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81672982）和四川省科技厅应用基础研究计划项目（编号：2016JY0050）资助

卢铀 radyoulu@hotmail.com

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672982)and the Applied Basic Research Programs of Science and Technology Department of Sichuan Province(No.2016JY0050)

（2017-03-14收稿）

（2017-07-05修回）

（编辑：杨红欣 校对：武斌）

尹利梅 专业方向为肺癌的放射治疗与免疫治疗。

E-mail：limei-yin@foxmail.com