TRPV5 TRPV6对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响*

张慧 刘模荣 董辉 徐靖宇 谢睿 文国荣 刘莲花

·基础研究·

TRPV5 TRPV6对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响*

张慧①刘模荣①董辉②徐靖宇①谢睿①文国荣①刘莲花①

目的：观察TRPV5和TRPV6蛋白表达水平对结肠癌SW480细胞内Ca2+水平及细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响。方法：给予TRPV5、TRPV6通道激动剂1-25（OH）2D3及抑制剂CuCl2作用结肠癌SW480细胞后，采用免疫组织化学法、Western blot及实时荧光定量PCR技术检测TRPV5、TRPV6蛋白及TRPV5、TRPV6 mRNA表达的变化。使用高速离子成像系统观察结肠癌SW480细胞内Ca2+水平的变化；通过MTT法、TUNEL法及划痕修复法观察结肠癌SW480细胞增殖、凋亡及迁移的变化。结果：1-25（OH）2D3明显上调结肠癌SW480细胞TRPV5、TRPV6 mRNA及蛋白表达水平，使结肠癌SW480细胞内Ca2+水平增加，促进结肠癌SW480细胞增殖、迁移及抑制其凋亡（P＜0.05）。CuCl2明显下调结肠癌SW480细胞中TRPV5、TRPV6蛋白及mRNA表达，使结肠癌SW480细胞内Ca2+水平降低（P＜0.05），抑制结肠癌SW480细胞的增殖、迁移及促进细胞的凋亡（P＜0.05）。结论：结肠癌SW480细胞中TRPV5和TRPV6蛋白表达水平的变化，能通过调控细胞内Ca2+水平影响细胞的增殖、迁移和凋亡等生物学行为。

结肠癌 钙离子通道 TRPV5 TRPV6 Ca2+

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病机制目前尚不明确。有研究发现在肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展过程中均伴随着细胞内Ca2+水平的改变［1-2］，TRPV5和TRPV6是瞬时性受体电位通道（TRP）超家族中的成员，是一种与Ca2+转运有关的存在于细胞膜上的特定蛋白质，其功能受1-25（OH）2D3、甲状旁腺激素（PTH）、饮食钙、雌激素和药物等影响的调节［3］，与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化及侵袭密切相关［4］。通过调控细胞内的钙信号及其相关的信号通路能够影响肿瘤的增殖、迁移、凋亡等多种生物学行为。本研究拟应用TRPV5和TRPV6通道激动剂1-25（OH）2D3和抑制剂CuCl2作用于结肠癌SW480细胞，观察药物作用前后结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6蛋白表达和细胞内Ca2+水平变化，以及对细胞的增殖、迁移及凋亡的影响。希望通过对钙信号及其调控的通道的研究，为结肠癌的治疗寻找新的机制及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株SW480细胞购自中国科学院上海生物化学研究所，并常规消化传代保存。TRPV5、TRPV6多克隆抗体购自美国Abcam公司，GTVisionT⁃MIII抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒购自上海基因科技有限公司，引物合成于上海生工公司。Fura-2钙荧光染料购自美国Invitrogen公司。1-25（OH）2D3购自美国SIGMA公司，CuCl2购自上海国产分析纯试剂。改良型RPMT 1640培养基和Hyclone胎牛血清购自美国Hyclone公司。凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒和MTT试剂盒购自南京凯基生物公司，逆转录试剂盒和RT-PCR扩增试剂盒购自大连TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将结肠癌SW480细胞培养于含10%胎牛血清的改良型RPMT 1640培养基中，培养条件为5%CO2、饱和湿度、恒温37℃，静置培养。对细胞常规进行换液、消化、传代。

1.2.2 观察不同药物对SW480细胞形态变化的影响 将对数期的结肠癌SW480细胞常规消化、传代、计数，分别接种在3个培养皿中，培养24 h后，其中两组分别加10-8mol/L 1-25（OH）2D3和100 μmol/L Cu⁃Cl2，另一组不加药物处理作为对照组，继续培养48 h后磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，倾去上层悬浮细胞后将培养皿置于倒置显微镜下，观察不同药物对SW480细胞的形态和数量变化的影响。

1.2.3 免疫组织化学法检测结肠癌SW480细胞中TRPV5、TRPV6的表达 将结肠癌SW480细胞常规消化传代后接种、分组、加药（分别加入10-8mol/L 1-25（OH）2D3和100 μmol/L CuCl2），培养箱中培养48 h，然后固定爬片、封闭，每张玻片滴加稀释好的一抗（TRPV5：PBS=1:3 000/TRPV6：PBS=1:3 000）；以PBS代替一抗，其他步骤不变作为阴性对照，4℃孵育过夜，滴加即用型二抗、孵育、浸洗、滴加显色剂DAB液约50 μL/片（1:50），并在光镜下控制显色，显色完全后及时终止显色；苏木素复染5min；自来水冲洗10min，1%盐酸酒精分化3 s；自来水水洗返蓝；待玻片自然干后用中性树胶封片。

1.2.4 RT-PCR实验 将结肠癌SW480细胞常规消化传代后接种、分组、加药（同免疫组织化学法）、培养结束后收集细胞，采用Trizol提取法抽提细胞总RNA，沉淀用100 μL二乙基焦碳酸酯处理水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度（OD260/OD280比值为1.8～2.0）后，按照逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA（200 ng/μL）备用。使用Bio-Rad iQ5。TRPV5的上游引物为：5'-GACAAGGAGGATGACCAGGA-3'；下游引物为：5'-AGGGAGGSSGTTGGAAGAGC-3'。TRPV6的上游引物为：5'-CCTTTGCTGCCTGTGTGA AC-3'；下游引物为：5'-GCTGGAGGATGAGGATGTG T-3'。扩增条件：预变性95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s进行40个循环。采用相对定量2-ΔΔCt法计算药物处理SW480细胞前后TRPV5及TRPV6基因表达的倍数关系。

1.2.5 Western blot检测 将结肠癌SW480细胞常规消化传代后接种、分组、加药（同免疫组织化学法），培养结束后收集细胞采用RIPA提取细胞蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取蛋白液加入等量的上样缓冲液后在100℃煮沸5 min，配置10%的分离胶10 mL和5%积层胶，上样电泳结束后转膜2 h、采用5%脱脂奶粉封闭、TBST溶液洗膜后加入一抗4℃孵育过夜（1:1 000稀释，TRPV5/TRPV6的分子量均为83 kDa）、洗膜后再加入二抗孵育2 h，采用化学荧光法（ECL）显色曝光、凝胶成像系统分析条带灰度值后分析统计。

1.2.6 结肠癌SW480细胞内Ca2+测定 将结肠癌SW480细胞常规消化、计数、接种，培养箱中培养，将实验分为正常对照组（PBS）、刺激通道组（10-8mol/L 1-25（OH）2D3）、阻断通道组（100 μmol/L CuCl2）。用PBS液漂洗细胞3次，每次2 min，然后加入钙的发光剂Fura-2（Fura-2：PBS=1:1 000），室温避光孵育负载60 min，孵育结束再用PBS液漂洗3次，以充分洗去胞外留的Fura-2，然后再用PBS浸泡30 min使Fura-2去酯化，待上机测定；将准备好的细胞爬片和灌流槽放置于倒置荧光显微镜上，实验开始时先用PBS液灌流结肠癌SW480细胞3 min，待条件稳定细胞适应后，开始进行检测，先找到细胞层面，用340 nm波长的激光激发Ca2+荧光探针Fura-2发射荧光，用CCD拍摄荧光的动态变化并通过钙荧光成像系统进行分析。

1.2.7 MTT比色法 对SW480细胞进行常规消化、计数、种板，按2×104个细胞/孔接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液200 μL；边缘孔用无菌PBS填充；5%CO2、37℃孵育静置培养；24 h后待细胞稳定贴壁，同时设置对照组（加细胞及培养液）、空白孔（只加培养基）、溶剂对照组（加入乙醇使其终浓度为0.1%）及药物实验组，分别加入1-25（OH）2D3用0.1%乙醇溶解的相应培养液，使其终浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6mol/L；CuCl2的浓度为1.0、10、100、200 μmol/L，每组设5个平行孔，经孵育后在酶联免疫检测仪上测定波长OD490nm对应OD值，有效实验重复3次。结果分析统计：细胞生长抑制率（%）=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%；细胞生长增殖率（%）=（实验组吸光值-对照组吸光值）/对照组吸光值×100%。

1.2.8 细胞迁移实验 在12孔板背面用消毒的直尺和Marker笔间隔0.5 cm划线，一般划4～5条，用于标记；制备单层细胞，待细胞长到80%～90%划痕：用200 μL灭菌枪头在贴壁的单层细胞上呈“一”字划痕；于划痕后0、24、48 h，在倒置显微镜下观察划痕宽度并照相，再次拍照前弃去培养基，用PBS清洗3次后在倒置显微镜下寻找到原位置拍照对比。细胞迁移能力计算的公式：迁移指数（%）=（初始划痕宽度-愈合后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.9 TUNEL法检测细胞凋亡 将结肠癌SW480组织进行常规消化、计数、爬片、分组、加药（同免疫组织化学法），培养48 h后，固定、0.1%Triton X-100通透、滴加封闭液封闭，然后浸洗；制作阳性片（按凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书），TUNEL染色中凋亡率的统计分析，阳性结果判定：以细胞核染成棕色或棕褐色者为阳性细胞，在高倍镜下任意选5个视野，每个视野下计数200个细胞（细胞总数），并按公式计算出结肠癌SW480细胞凋亡指数（apopto⁃sis index，AI）=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6蛋白的表达变化

免疫组织化学法测定结果显示TRPV5、TRPV6的表达定位主要在细胞膜及胞浆中（棕黄色区域），激动剂1-25（OH）2D3组TRPV5、TRPV6的阳性表达明显增强，而抑制剂CuCl2组TRPV5、TRPV6阳性表达明显减弱，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 免疫组织化学法测定各组结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6蛋白的表达Figure 1 Protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cells by immunocytochemistry

2.2 Western blot检测1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6蛋白的表达变化

Western blot检测结果显示TRPV5、TRPV6均为单一目的条带（分子量为83 kDa），1-25（OH）2D3刺激结肠癌SW480后TRPV5、TRPV6蛋白的表达明显上调，相反CuCl2作用后TRPV5、TRPV6的蛋白表达明显下调，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 Western blot测定各组结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6蛋白的表达Figure 2 Protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cells by Western blot analysis

2.3 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6 mRNA水平的表达变化

RT-PCR的方法检测显示1-25（OH）2D3刺激结肠癌SW480后TRPV5、TRPV6的mRNA表达明显上调，相反CuCl2作用后TRPV5、TRPV6的mRNA表达水平却明显下调，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.4 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后结肠癌SW480细胞内Ca2+浓度的变化

在Ca2+荧光探针（Fura-2）的标记下，结肠癌SW480细胞内Ca2+显示为绿色荧光，随着细胞内Ca2+浓度的上升，胞内结合态染料浓度升高，其在340 nm左右的吸收峰增强。用1-25（OH）2D3（10-8mol/L）作用结肠癌SW480细胞后，细胞内Ca2+荧光强度较对照组表达增加。用 CuCl2（100 μmol/L）作用结肠癌SW480细胞后，细胞内Ca2+荧光强度较对照组表达降低，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。肠癌SW480细胞形态变化的影响。未经药物作用的SW480细胞融合成单层，细胞为梭形、三角形或者多边形，并可见处于分裂相的细胞（图4A）。经1-25（OH）2D3作用后，SW480细胞融合致密成单层，细胞间连接紧密，边界清楚，胞浆丰富，并可见多个处于分裂相的细胞（图4B）。经CuCl2作用后，细胞逐渐皱缩变长、细胞间隙增大、分裂相细胞数目减少，有部分细胞失去原贴壁形态（图4C）。

表1 TRPV5、TRPV6mRNA在结肠癌SW480细胞中的表达 （x±s）Table 1 Expression levels of TRPV5 and TRPV6 mRNA in SW480 colon cancer cell in terms of mean±SD

图3 1-25(OH)2D3、CuCl2对结肠癌SW480细胞内Ca2+水平的影响（F340 nm×400）Figure 3 Intracellular Ca2+in SW480 colon cancer cells treated with 1-25(OH)2D3and CuCl2(F340nm×400)

2.5 1-25（OH）2D3和CuCl2对结肠癌SW480细胞生长的影响

2.5.1 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后细胞形态的变化 在倒置显微镜下观察不同药物作用48 h后对结

图4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用48 h后结肠癌SW480细胞形态（×200）Figure 4 Effect of 48 h treatment of 1-25(OH)2D3and CuCl2on SW480 colon cancer cell morphology

2.5.2 1-25（OH）2D3和CuCl2对结肠癌SW480细胞增殖的影响 MTT结果证实不同浓度的1-25（OH）2D3和CuCl2分别刺激结肠癌SW480细胞24、48和72 h后，1-25（OH）2D3对SW480细胞有促增殖作用，而Cu⁃Cl2则对SW480细胞的增殖具有抑制作用，且呈时间剂量依赖性，10-8mol/L的1-25（OH）2D3和100 μmol/L CuCl2在刺激SW480细胞72 h后对增殖的影响最明显，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，表2，3）。

表2 1-25(OH)2D3对结肠癌SW480细胞生长增殖的影响（OD490/增殖率）（n≥3，x±s）Table 2 Effect of 1-25(OH)2D3on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/proliferation rate,n＞3)in terms of mean±SD

表3 CuCl2对结肠癌SW480细胞生长增殖的影响（OD490/抑制率）（n≥3±s）Table 3 Effect of CuCl2on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/inhibiting rate,n＞3)in terms of mean±SD

表3 CuCl2对结肠癌SW480细胞生长增殖的影响（OD490/抑制率）（n≥3±s）Table 3 Effect of CuCl2on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/inhibiting rate,n＞3)in terms of mean±SD

*:Versus control group,P＜0.05

Group(mol/L)Control 1 10 100 200 24 h 48 h 72 h OD4900.455±0.019 0.429±0.021*0.412±0.002*0.358±0.018*0.325±0.042*Inhibiting rate(%)0 5.79 9.45 21.32 28.57 OD4900.627±0.021 0.573±0.017*0.548±0.007*0.372±0.024*0.349±0.006*Inhibiting rate(%)0 8.47 12.41 40.54 44.22 OD4900.731±0.016 0.684±0.022*0.624±0.021*0.426±0.021*0.398±0.002*Inhibiting rate(%)0 10.34 14.56 41.67 45.51

2.5.3 1-25（OH）2D3和CuCl2对结肠癌SW480细胞凋亡的影响 经TUNEL法检测凋亡细胞，在光学显微镜下观察，凋亡细胞体积缩小，核固缩，边界清楚，细胞质淡染，染色质呈特异的棕黄色着染。正常培养组可见少量凋亡细胞；1-25（OH）2D3作用组可见到极少量的凋亡细胞，CuCl2作用组可见到大量的凋亡细胞，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，表4）。

表4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用结肠癌SW480细胞48 h后细胞凋亡率的比较 （±s）Table 4 Comparison of SW480 colon cancer cell apoptosis induced by 1-25(OH)2D3and CuCl2for 48 h in terms of mean±SD

表4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用结肠癌SW480细胞48 h后细胞凋亡率的比较 （±s）Table 4 Comparison of SW480 colon cancer cell apoptosis induced by 1-25(OH)2D3and CuCl2for 48 h in terms of mean±SD

*:Versus control group,P＜0.05;#:versus 1-25(OH)2D3group,P＜0.05

Group Control 1-25(OH)2D3CuCl2n10 10 10 Positive cells 6.333±1.528 2.667±0.577*50.667±2.512*#AI(%)3.16 1.33 25.33

2.6 1-25（OH）2D3和CuCl2对结肠癌SW480细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，初始时所有组的划痕宽度基本上相等。经1-25（OH）2D3和CuCl2分别作用24、48 h后，1-25（OH）2D3对结肠癌SW480细胞迁移有明显的促进作用，而CuCl2对结肠癌SW480细胞迁移有抑制作用，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图5，6）。

图5 结肠癌SW480细胞划痕实验Figure 5 Migration of SW480 colon cancer cell during scratch test

图6 结肠癌SW480细胞划痕实验（标尺：500 μm）Figure 6 Migration of SW480 colon cancer cell scratch test(bar:500 μm)

3 讨论

TRPV5和TRPV6是TRP超家族中目前唯一已知的两种Ca2+高选择性通道，其主要负责Ca2+由细胞外向细胞内的主动跨膜运输，在机体内参与多项生理活动的调节，包括肌肉收缩、递质释放、细胞增殖、迁移及细胞凋亡等［5］。TRPV6是在肠上皮中表达的钙通道蛋白，主要位于结肠吸收表面的顶膜中，是一种可以调节肠钙吸收的速度和程度的蛋白质，其功能受1-25（OH）2D3通过VDR信号通路的调节。TRPV5主要表达于肾小管上皮细胞，在结肠组织中仅有少量表达。这可能与TRPV5和TRPV6蛋白结构的不同有关［6］。有研究发现，TRPV6在前列腺癌中的表达水平随恶性程度及转移程度的加深而增加，敲除TRPV6可抑制前列腺癌细胞增殖，认为可能与其能促进钙内流，激活NFAT有关［7］。在结肠癌发生发展过程中，TRPV6在正常结肠组织、溃疡性结肠炎、结肠腺瘤及结肠腺癌中表达逐渐增加［8-9］。TRPV6在Ⅰ期结肠癌中的表达为66%，在Ⅱ期结肠癌中的表达为17%，在Ⅲ、Ⅳ期结肠癌中却几乎无表达，认为TRPV6表达增高主要发生在结肠癌早期，而这种伴随结肠黏膜增生的TRPV6异常高表达可通过高钙饮食来减弱甚至逆转［6］。SOR-C13（一种TRPV6的抑制剂）被临床用来治疗胰腺癌并取得一定疗效［10］。上述研究表明TRPV6表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关，但具体机制仍有待进一步研究。

本研究发现TRPV5、TRPV6在结肠癌SW480细胞中表达于胞膜及胞浆。1-25（OH）2D3（10-8mol/L）能上调TRPV5和TRPV6 mRNA及蛋白的表达，而与之相反，CuCl2（100 μmol/L）则下调TRPV5和TRPV6 mRNA及蛋白表达，组间相比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。经高速离子成像系统测定发现，1-25（OH）2D3通过增加结肠癌SW480细胞TRPV5和TRPV6通道的表达，促使细胞外Ca2+经钙通道进入细胞内，增加了细胞内Ca2+水平；而CuCl2作用则与之相反。可能与1-25（OH）2D3和CuCl2影响了TRPV5、TRPV6的活性有关。

随着TRPV5和TRPV6表达的变化及细胞内Ca2+水平的改变，结肠癌SW480细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为也受到相应的影响。本研究通过MTT、划痕法、TUNEL法研究发现，1-25（OH）2D3能促进结肠癌SW480细胞增殖和迁移，抑制结肠癌SW480细胞的凋亡（P＜0.05）；而CuCl2则抑制结肠癌SW480细胞增殖和迁移（P＜0.05），促进结肠癌SW480细胞的凋亡（P＜0.05）。1-25（OH）2D3和CuCl2分别在浓度10-8mol/L和100 μmol/L作用48 h较明显，表现出一定的时间剂量依赖性。提示TRPV5、TRPV6可通过控制Ca2+的内流，来调节结肠癌SW480细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为［11］，其机制可能与下调p-AKT/GSK3信号通路有关［12］。

本实验仅通过改变TRPV5、TRPV6功能状态观察其对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响，但TRPV5、TRPV6对结肠癌SW480细胞增殖、迁移、凋亡的确切机制尚不明确，其可能通过调控Ca2+影响细胞周期，或者与相关调节基因表达有关。TRPV5、TRPV6之间有无竞争性或协同性，以及在正常组织细胞与肿瘤细胞、离体细胞与机体组织细胞之间作用有无差异，尚需进一步研究。

[1]Xie R,Xu J,Wen G,et al.The P2Y2 nucleotide receptor mediates the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma cells induced by ATP[J].J Biol Chem,2014,289(27):19137-19149.

[2]Davis FM,Azimi I,Faville RA,et al.Induction of epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer cells is calcium signal dependent[J].Oncogene,2014,33(18):2307-2316.

[3]Lehen'kyi V,Raphaël M,Prevarskaya N.The role of the TRPV6 channel in cancer[J].J Physiol,2012,590(6):1369-1376.

[4]Chen J,Luan Y,Yu R,et al.Transient receptor potential(TRP)channels,promising potential diagnostic and therapeutic tools for cancer[J].Biosci Trends,2014,8(1):1-10.

[5]Li SL,Wang HP,Cai WS.The expression of TRPV channel families in germs of human ejaculated semen[J].Clinical Medicine&Engineering,2011,18(7):979-984.[李世林,王怀鹏,蔡伟山.TRPV离子通道家族在人精液生殖细胞中的表达及定位[J].临床医学工程,2011,18(7):979-984.]

[6]Peleg S,Sellin JH,Wang Y,et al.Suppression of aberrant transient receptor potential cation channel,subfamily V,member 6 expression in hyperproliferative colonic crypts by dietary calcium[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010,299(3):G593-601.

[7]Monet M,Lehen'kyi V,Gackiere F,et al.Role of cationic channel TRPV2 in promoting prostate cancer migration and progression to and rogen resitance[J].Cancer Res,2010,70(3):1225-1235.

[8]Liu W,Liu MR,Zhang H.Expression of TRPV5 and TRPV6 in development of colonic adenocarcinoma[J].World Chinese Journal of Digestology,2014,22(35):5422-5431.[刘微,刘模荣,张慧.TRPV5、TRPV6在结肠腺癌发生发展过程中的表达及意义[J].世界华人消化杂志,2014,22(35):5422-5431.]

[9]Zhang H,Liu MR,Liu W.TRPV6 and Ki-67 expression in ulcerative colitis and colon carcinoma[J].World Chinese Journal of Digestology,2014,22(36):5732-5736.[张慧,刘模荣,刘微.TRPV6、Ki-67 在溃疡性结肠炎、结肠癌中的表达及意义[J].世界华人消化杂志,2014,22(36):5732-5736.]

[10]Fu S,Hirte H,Welch S,et al.First-in-human phase I study of SORC13,a TRPV6 calcium channel inhibitor,in patients with advanced solid tumors[J].Invest New Drugs,2017,35(3):324-333.

[11]Kim SY,Yang D,Myeong J,et al.Regnlation of calcium influx and signaling pathway in cancer ceils via TRPV6-Numbl in.teraction[J].Cell Calcium,2013,53(2):102-111.

[12]Zhong XM,He JD,Chen XF.A novel transient receptor potential calcium channel subfamily V member 6(TRPV6):Its expression and clinical significance in stomach cancer[J].Chin J Cancer Biother,2015,22(1):73-78.[仲小敏,何敬东,陈小飞.新型钙离子通道蛋白TRPV6在胃癌组织中的表达及其临床意义[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2015,22(1):73-78.]

（2017-02-03收稿）

（2017-06-24修回）

Effect of TRPV5 and TRPV6 channels on the biological behaviors of SW480 colon cancer cell line

Hui ZHANG1,Morong LIU1,Hui DONG2,Jingyu XU1,Rui XIE1,Guorong WEN1,Lianhua LIU1

Morong LIU;E-mail:zylmr@163.com
1Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China;2Division of Gastroenterology,Department of Medicine,University of California,San Diego,School of Medicine,San Diego 92103,USA
This work was supported by Guizhou International Science and Technology Cooperation Program(No.G(2014)7014)

Objective:To investigate the role of TRPV5 and TRPV6 in intracellular calcium regulation and biological behaviors of SW480 colon cancer cells.Methods:qRT-PCR,Western blot,and immunocytochemistry were applied to determine the mRNA and protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cell line upon treatment with TRPV5 and TRPV6 agonist,1-25(OH)2D3,and inhibitor,CuCl2.The change of intracellular Ca2+level was examined with a confocal laser scanning microscope.Scratch test,MTT,and TUNEL assays were used to analyze the cell migration,proliferation,and apoptosis,respectively.Results:As an agonist of TRPV5 and TRPV6,1-25(OH)2D3significantly up-regulated the mRNA and protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 cell lines.On the other hand,CuCl2,being an inhibitor of TRPV5 and TRPV6,effectively down-regulated the TRPV5 and TRPV6 mRNA and protein expression levels(P＜0.05).The intracellular calcium concentration in SW480 cell line significantly increased upon treatment with 1-25(OH)2D3,and significantly decreased with CuCl2treatment(P＜0.05).1-25(OH)2D3promoted cell proliferation and migration,and inhibited apoptosis of SW480 cell in a time-and dose-dependent manner(P＜0.05).However,CuCl2significantly repressed cell proliferation and migration and induced apoptosis(P＜0.05).Conclusion:TRPV5 and TRPV6 can affect the biological behaviors of colon cancer SW480 cells by regulating intracellular Ca2+level.

colon cancer,calcium channel,TRPV5,TRPV6,Ca2+

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.114

①遵义医学院附属医院消化内科（贵州省遵义市563003）；②美国加利福尼亚大学医学院胃肠科

*本文课题受贵州省国际科技合作计划项目［编号：黔科合G字（2014）7014号］资助

刘模荣 zylmr@163.com

张慧 专业方向为早期结肠癌临床及基础研究。

E-mail：zhanghui1892@foxmail.com