免疫磁珠对肺腺癌小鼠模型micro-CT的增强作用*

王悦 潘世扬 朱娟娟 徐婷 徐建 刘京萍 王芳 顾春荣 张丽霞

免疫磁珠对肺腺癌小鼠模型micro-CT的增强作用*

王悦 潘世扬 朱娟娟 徐婷 徐建 刘京萍 王芳 顾春荣 张丽霞

目的：研究偶联单抗NJ001的免疫磁珠对肺腺癌裸鼠模型micro-CT扫描的增强作用。方法：经尾静脉注射SPC-A1-luc细胞建立肺腺癌裸鼠模型，生物发光成像定量监测肿瘤的大小。裸鼠分为：生理盐水组、裸磁珠组和免疫磁珠组，每周分别注射生理盐水、750 nm裸磁珠溶液和偶联NJ001的750 nm免疫磁珠溶液，于注射前和注射后4 h进行micro-CT扫描。利用免疫组织化学验证肿瘤组织中NJ001特异性抗原SP70的表达。结果：免疫磁珠组在第4周即可检测到肿瘤，而生理盐水组和裸磁珠组均到第6周才能检测到。第6周生理盐水组、裸磁珠组和免疫磁珠组micro-CT扫描肿瘤的灰度值分别为注射前的59.05±0.66、60.69±0.55和58.25±0.32，注射后的60.30±1.83、61.05±0.68和67.41±3.82。与注射前相比，免疫磁珠组注射后的灰度值显著增加，差异具有统计学意义（P=0.007 9）。生理盐水组和裸磁珠组注射后的灰度值与注射前相比差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论：偶联单抗NJ001的免疫磁珠对肺腺癌裸鼠模型micro-CT扫描有增强作用，并且有望用于肺癌的早期诊断。

肺腺癌 生物发光成像 micro-CT 免疫磁珠 NJ001

肺癌是当今世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，与癌症致死相关的病例中超过四分之一是肺癌患者［1］。低剂量CT技术是肺癌首选的诊断方法［2-3］，但CT对直径较小的早期肺癌灵敏度较低，并且是非特异性的检测手段，不利于肺癌患者的早期确诊。因此，在肺癌早期阶段，寻找特异性和灵敏度更高的检测方法对肺癌进行早期确诊已经成为近年来研究的热点［4-7］。

本研究前期从杂交瘤抗体库中筛选了一种单克隆抗体NJ001，能特异性识别肺腺癌及其他非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞中的SP70抗原，该抗原已被证实在NSCLC尤其是肺腺癌的细胞浆中和细胞膜上均呈高表达；同时，在NSCLC患者的血清及胸腔积液中的阳性率较高，因此该抗原有望成为新的肿瘤靶标［8-10］。本研究将单抗NJ001和750 nm磁珠偶联制备免疫磁珠，并利用其作为肺腺癌肿瘤特异性分子靶向成像的示踪物，探讨其对小鼠肺腺癌模型肺部肿瘤micro-CT信号的增强作用，从而提高micro-CT对肺腺癌的早期诊断能力。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性裸鼠15只（4周龄）购自上海斯莱克实验动物有限公司，稳定表达荧光素酶的SPC-A1-luc细胞购自上海百代安生物科技有限公司。RPMI 1640、胎牛血清（购自美国HyClone公司），荧光素酶底物（北京泛博生物化学有限公司），羊血清工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司），快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物及DAB显色试剂盒（福建迈新生物技术有限公司）。小动物可见光活体成像系统IVIS Spectrum（购自美国Caliper公司），小动物活体micro-CT影像系统Skyscan1176（购自比利时Bruker公司），PM3-050超顺磁性纳米微球（上海奥润微纳新材料科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 NJ001免疫磁珠的制备 取200 μL磁珠（2 mg），加入500 μL MEST，洗涤3次，磁珠分离后弃上清，分别加入200 μL ED（5 mg/mL）和200 μL NHS（5 mg/mL）涡旋混匀，水浴37℃活化30 min。上磁架分离，移除上清，加入500 μL MEST，转移至新的离心管。上磁架分离，移除上清，加入500 μL MEST洗2次，磁架分离，弃上清。加入250 μg（50 μL×5 μg/mL）NJ001抗体后，加入450 μL MEST混匀。37℃水浴中偶联4 h。磁架分离，弃上清，加入1 mL PBST（pH=7.4，含1%BSA）重悬，4℃过夜，摇床震摇。磁架分离，弃上清，500 μL PBST洗涤4次。磁架分离，弃上清，200 μL PBST（pH=7.4，含0.5%BSA+0.02%叠氮钠）重悬，4℃保存。将上述重悬液1:50稀释，即为注射到小鼠体内的浓度。

1.2.2 细胞培养及裸鼠肺腺癌模型的建立 裸鼠实验经南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会审查批准，批准编号：14030115。

SPC-A1-luc细胞生长于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。生长48 h后，取对数生长期的SPC-A1-luc细胞，用生理盐水重悬为5×107个/mL的悬液，通过裸鼠尾静脉注射100 μL细胞悬液。裸鼠饲养于SPF级环境中，室温26℃～28℃，湿度40%～60%，所用垫料、饮水、标准饲料及其他与实验动物接触的物品均经高压蒸汽灭菌处理。

15只裸鼠随机分为生理盐水组、裸磁珠组和免疫磁珠组，每周通过尾静脉分别注射100 μL生理盐水、100 μL 750 nm裸磁珠悬液（体积比为1:50稀释）、100 μL偶联NJ001的750 nm免疫磁珠悬液（体积比为1:50稀释），每周注射前和注射后4 h分别进行mi⁃cro-CT扫描。

1.2.3 小动物可见光活体成像 经尾静脉注射SPCA1-luc细胞的裸鼠，每周利用生物发光成像系统检测肺部生物发光信号值。检测时，每只裸鼠按150 mg/kg的量腹腔注射荧光素底物，异氟烷麻醉后10～15 min进行活体成像。成像后应用系统自带软件IVIS 2000系统（购自美国Caliper公司）检测肺部肿瘤生物发光信号强度。

1.2.4 micro-CT扫描 每周给裸鼠分别注射对应的溶液，采用小动物活体micro-CT影像系统检测裸鼠肺部肿瘤。裸鼠异氟烷麻醉后置扫描平台加呼吸门控，扫描电压为50 kV，电流455 μA，扫描分辨率35 μm，每次旋转角度为0.8°，共旋转360°。

1.2.5 免疫组织化学染色 标本切片经二甲苯脱蜡两次，梯度酒精（100%、100%、90%、80%、70%）进行水化，纯水浸洗2次；切片置于新鲜配制的3%过氧化氢溶液中，避光室温放置10 min后，PBS浸洗4次；擦干组织周围液体，滴加正常羊血清工作液，于湿盒中室温封闭2 h；吸走封闭液后滴加1:50稀释的1 mg/mL单克隆抗体NJ001，置于湿盒中放入4℃冰箱孵育过夜；次日，取出湿盒室温平衡约20 min，PBS浸洗切片；擦干液体，滴加酶标记羊抗鼠IgG聚合物工作液，37℃孵育15 min；PBS浸洗切片，擦干液体，加DAB显色液显色，适时终止，纯水冲洗；苏木素复染约30 s，1%盐酸酒精分化5 s，流水冲洗30 min反蓝，梯度酒精（70%、80%、90%、100%、100%）脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。晾干切片，显微镜下拍照，观察染色情况。

1.3 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，结果以±s表示。符合正态分布的两组间比较采用配对样本t检验，不符合正态分布的两组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验，3组间比较采用Dunnett's（T3）检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物发光成像监测肺部肿瘤的生长

裸鼠尾静脉接种SPC-A1-luc细胞后，每周注射荧光素底物进行生物发光成像（图1A、B）接种后肺部生物发光信号由弥散分布到逐渐聚集于裸鼠肺部，且第2周开始裸鼠肺部生物发光信号随时间延长而升高，可见肺部已经形成实体瘤。第6周每组裸鼠生物发光光子数（图1C），各组间裸鼠生物发光信号强度差异无统计学意义。

2.2 用micro-CT监测和诊断裸鼠肺部肿瘤

每周给3组裸鼠通过尾静脉注射相应的溶液：生理盐水组每只注射生理盐水100 μL，裸磁珠组注射1:50稀释的750 nm磁珠悬液100 μL，免疫磁珠组注射1:50稀释的偶联NJ001的750 nm磁珠溶液100 μL。免疫磁珠组在第4周就可以检测到肿瘤，并且随着时间延长肿瘤不断增大，生理盐水组和裸磁珠组均到第6周才检测到肿瘤（图2）。

图1 生物发光成像监测肺部肿瘤的形成和发展Figure 1 Bioluminescence imaging monitoring the formation and development of lung tumor

▶图2 免疫磁珠悬液对裸鼠肺部肿瘤的早期诊断Figure 2 Early diagnosis of lung cancer in nude mice after injection of immunomagnetic bead solution

2.3 免疫磁珠对micro-CT的信号增强作用

每周注射前和注射后4 h后均进行micro-CT扫描，第6周结果如图3A所示，免疫磁珠组注射后比注射前的肿瘤密度显著增加，其余两组注射前后肿瘤密度没有明显差异。第6周生理盐水组、裸磁珠组和免疫磁珠组micro-CT扫描的肿瘤灰度值分别为注射前的59.05±0.66、60.69±0.55和58.25±0.32，注射后的60.30±1.83、61.05±0.68和67.41±3.82（图3B）。与注射前相比，免疫磁珠组注射后肿瘤的灰度值显著增加，差异具有统计学意义（P=0.007 9）。生理盐水组和裸磁珠组注射后的灰度值与注射前相比均差异无统计学意义（均P＞0.05）。

图3 免疫磁珠溶液注射前后micro-CT扫描的信号变化Figure 3 Signal change of micro-CT scan after injection of immunomagnetic bead solution

2.4 免疫组织化学验证肿瘤细胞中SP70的表达

注射肿瘤细胞后第9周处死裸鼠，取出肺部肿瘤组织，石蜡包埋，同时解剖一只健康裸鼠，取肺部组织做石蜡切片，进行免疫组织化学染色。健康鼠细胞形态正常，一抗NJ001做免疫组织化学染色，结果呈阴性；肺癌鼠肿瘤细胞形态不规则，细胞核大而深染，免疫组织化学可见NJ001可识别肺癌组织中的SP70抗原，结果呈阳性（图4）。

图4 针对SP70的免疫组织化学染色（×200）Figure 4 Expression of SP70 by IHC staining(×200)

3 讨论

尽管临床上有影像学和病理学等手段用于诊断非小细胞肺癌（NSCLC），但由于早期确诊率较低，影响了治疗效果。NSCLC的早期诊断，对于改善其预后十分重要［11］。计算机断层扫描（CT）是NSCLC诊断中应用最广泛的影像学技术，但受成像原理的限制，CT分辨软组织的微小变化较为困难［12-13］。虽然造影剂可通过增加软组织的对比度提高肺癌诊断的准确性，但其在使用过程中易导致造影剂肾病等较严重并发症［14-15］。并且，目前常用的造影剂特异性不强，其本身对于病变组织无亲和力，只能进行非特异性显影，同样无法判断病变性质，严重限制了显像技术的进一步临床应用。

近年来，纳米材料应用到影像学技术中的研究越来越多，相比传统造影剂，纳米粒子血液循环时间较长，肾清除率和毛细血管渗漏率较低，具有更好的生物相容性，在肿瘤的可视化成像中具有明显的优势［16］。不断完善的纳米材料用作CT增强剂能够对病变组织进行部位的精确成像，由此提高肿瘤确诊率，为确定治疗方案提供依据。然而，目前研究的纳米材料多是非特异性的或者被动靶向制剂，将其偶联上抗体等靶向分子，使之具有主动靶向作用，可进一步增强特定组织器官及肿瘤的特异性成像效果［17］。

本课题组前期研究中，从制备的抗肿瘤单克隆抗体库中筛选出一株杂交瘤细胞株，其所分泌的单克隆抗体被命名为NJ001。经鉴定，NJ001单克隆抗体特异性识别抗原的相对分子质量为70 kDa，因此该抗原被本研究命名为SP70。免疫荧光证实SP70抗原主要存在于SPC-A1细胞的胞浆和胞膜上［18］。众所周知，具有较高密度的金属材料能吸收X射线，具有优良的性能，可用作X射线成像的增强剂［17］。肿瘤血管与正常血管不同，纳米粒子可以通过血管内皮细胞间隙外渗并积累在肿瘤病灶［19］。本实验中使用的磁珠为超顺磁性纳米颗粒，直径为750 nm。将该磁珠与单抗NJ001偶联后，可以特异性结合并聚集到表达SP70的肿瘤上而增强显像效果。

本研究中，通过尾静脉给裸鼠注射SPC-A1-luc细胞建立裸鼠肺腺癌模型后，利用生物发光成像技术对肺部肿瘤进行定量分析并能监测建模后肺腺癌肿瘤的生长情况［20］。本研究中成功建立了肺腺癌裸鼠模型，检测结果显示，生物发光光子数无显著性差异，因此各组裸鼠肺部肿瘤大小之间无明显差别。经免疫组织化学检测，进一步验证本研究所制备的肺腺癌裸鼠模型的肿瘤组织细胞中SP70表达为阳性。micro-CT扫描结果显示，注射免疫磁珠组的肺腺癌模型裸鼠肺内于第4周即显示存在明显肿瘤病灶；然而，生理盐水组和裸磁珠组均到第6周才检测到肿瘤。另外，在第6周时micro-CT扫描信号，免疫磁珠组注射后比注射前显著增强，而生理盐水组和裸磁珠组注射前后均无明显变化。表明磁珠与单抗NJ001偶联后所制备的免疫磁珠特异性增强了mi⁃cro-CT扫描检查信号，提高了显像效果。尤其对于早期较小的病灶，采用micro-CT扫描技术病灶结果为阴性，通过本技术进行特异性的分子靶向性增强显影，可以提高对肺腺癌的早期诊断效率。这是初次探究免疫磁珠溶液对micro-CT的信号增强作用，对不同直径磁珠对micro-CT增强效果的是否存在差异，以及磁珠溶液的代谢过程等问题，仍有待进一步研究。

本研究结果表明，特异性单抗NJ001与磁珠偶联后的免疫磁珠可增强micro-CT扫描信号，为未来建立新的肺腺癌等肿瘤的早期分子靶向影像诊断技术奠定了基础。

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（2017-03-13收稿）

（2017-05-18修回）

Enhanced effect of immunomagnetic beads on micro-CT scan of the lung adenocarcinoma mouse model

Yue WANG,Shiyang PAN,Juanjuan ZHU,Ting XU,Jian XU,Jingping LIU,Fang WANG,Chunrong GU,Lixia ZHANG

Shiyang PAN;E-mail:sypan@njmu.edu.cn
Department of Laboratory Medicine,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672100)

Objective:To study the signal enhancement of lung adenocarcinoma nude mice after injection of immunomagnetic bead solution(magnetic beads conjugated with monoclonal antibody NJ001)in micro-CT scan.Methods:The models of lung adenocarcinoma nude mice were established by injecting SPC-A1-luc cells through the tail vein and were validated by bioluminescence imaging(BLI).The nude mice were divided into three groups:physiological saline group,bare magnetic bead group,and immunomagnetic bead group.Three groups of nude mice were injected with physiological saline,750 nm bare magnetic bead solution,and immunomagnetic bead solution via the tail vein every week,and micro-CT scan was taken before and 4 h after injection.Immunohistochemistry(IHC)was used to detect the expression of antigen SP70 in tumor tissues.Results:The tumor was detected in the immunomagnetic bead group at the fourth week,whereas in the physiological saline and bare magnetic bead groups,the tumor was undetectable until the sixth week.The tumor intensities detected at the sixth week by micro-CT scan in the physiological saline,bare magnetic bead,and immunomagnetic bead groups were 59.05±0.66,60.69±0.55,and 58.25±0.32 before injection and 60.30 ± 1.83,61.05±0.68,and 67.41±3.82 after injection,respectively.Compared with the tumor intensities before injection,they significantly increased after injection in the immunomagnetic bead group;the difference was statistically significant(P=0.0079).By contrast,no statistical significance was observed in the tumor intensities before and after injection in the physiological saline and bare magnetic bead groups(P=0.1867 and P=0.3839,respectively).Conclusion:The immunomagnetic beads had enhanced effect on micro-CT scan of lung adenocarcinoma nude mouse models.

lung adenocarcinoma,bioluminescence imaging,micro-CT,immunomagnetic beads,NJ001

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.286

南京医科大学第一附属医院检验学部（南京市210029）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81672100）资助

潘世扬 sypan@njmu.edu.cn

王悦 专业方向为肿瘤分子诊断。

E-mail：wangyue3768@163.com