结直肠癌中微卫星不稳定性与PD-L1表达的关系及临床意义

冯稳 吴新新 郭永军 常玉喜 夏庆欣

·临床研究与应用·

结直肠癌中微卫星不稳定性与PD-L1表达的关系及临床意义

冯稳①吴新新②郭永军②常玉喜②夏庆欣①

目的：研究PD-L1在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中的表达及临床意义。方法：选取2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例，分为微卫星高度不稳定（high-frequency microsatellite instability，MSI-H）、微卫星低度不稳定（low-frequency microsatellite instability，MSI-L）、微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）3个组，采用免疫组织化学法检测各组织标本中细胞程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表达，分析PD-L1在各型CRC中的表达特点。结果：PD-L1在低分化CRC中的表达高于中、高分化CRC（P＜0.05），PD-L1在MSI-H的CRC中阳性率为75.8%，在MSIL/MSS中的阳性率为9.3%，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达，尤其是在MSIH的CRC阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。

PD-L1 结直肠癌 免疫组织化学 临床意义

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，目前其发病率居全球所有恶性肿瘤的第3位，在中国的发病率也呈逐步上升趋势［1-2］。除了传统的手术和放化疗，近年来分子靶向治疗在特定患者人群中表现出显著的疗效。细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）能够抑制T细胞的活化与增殖，诱导T细胞凋亡，从而维持机体的免疫平衡，避免自身的免疫损伤［3-4］。PD-L1抗体可用于治疗多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、卵巢癌等［4-6］。本研究探讨PD-L1在CRC中的表达及临床意义，以期为PD-L1在结直肠癌个体化精准治疗的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集2015年1月至2016年1月在郑州大学附属肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者210例临床资料，手术前均未接受任何治疗，排除标准：遗传性腺瘤性息肉病及遗传性非息肉性结直肠癌患者。入组患者手术石蜡组织标本，包括210例肿瘤组织、50例癌旁正常组织（距离癌变组织边缘直径＞5 cm，术后切缘病理未见肿瘤细胞）。本研究得到郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。入组患者的基本资料：男性118例，女性92例；年龄31～85岁，平均年龄63.5岁；右半结肠（升结肠和右半横结肠）43例，左半结肠（左半横结肠，降结肠和乙状结肠）32例，直肠135例。病理分期标准按照美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌第7版TNM分期标准［7］。

1.1.2 取材和病理切片的制备 手术切除新鲜结直肠组织标本后送病理科，每例患者留取癌组织及癌旁组织标本各一块，以10%福尔马林固定溶液固定24 h以上，制备石蜡包块，制作连续切片厚度4 μm，分别常规以苏木素-伊红（HE）染色、PD-L1免疫组织化学染色，显微镜下观察并拍照。

1.2 方法

1.2.1 MSI的检测 本研究使用MSI检测试剂盒检测贝斯塔遗传标记（Bethesda Marker）：Bat25、Bat26、D5S346、D2S123和D17S250共5个位点，正向引物标记荧光，对同一患者的肿瘤组织和正常黏膜组织的DNA进行PCR扩增，再用毛细管电泳检测扩增的产物，判断检测的肿瘤组织和正常黏膜组织是否存在微卫星不稳定性。5对引物来自美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因库，上游引物5'端分别作3种不同颜色的荧光标记。相对分子量标准采用美国ABI公司的GS-500LIZ Size Standard内标。同色引物扩增产物长度有别，可同时对多个位点进行片段分析，引物序列见表1。

1.2.2 免疫组织化学染色法 切除的组织标本用甲醛溶液固定，石蜡包埋，组织切片的厚度为4 μm，将其置于玻璃片上，用二甲苯脱蜡，在梯度乙醇内水化，在900 W微波加热2 s，进行抗原修复后，于0.3%的H2O2液中浸泡30 min阻断内源性抗原，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗3次，用10%正常的血清阻断背景非特异性的染色，加一抗置于湿盒内孵育过夜。一抗为兔抗人PD-L1单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），1:100稀释。生物素包被的鼠抗兔抗体孵育30 min后使用PBS洗3次，再用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物孵育30 min，然后使用苏木素复染。以正常小鼠的IgG代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 免疫组织化学结果判读标准 本研究使用免疫组织化学SP法检测PD-L1在CRC癌组织中的表情况，参考杨军等［8］的免疫组织化学检测结果判读方法对结果进行判断统计。免疫组织化学切片由病理科医师判读，PD-L1定位于肿瘤细胞膜或细胞浆，当所观察指标定位部位出现棕黄色颗粒为阳性表达。直接计算阳性细胞数（或面积）占视野下或整张切片内同类细胞数（或面积）的百分比进行分级。阴性（0）：无着色；弱阳性（+）：任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色；阳性（++）：＞10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色；强阳性（+++）：＞30%的细胞呈现强、完整膜棕褐着色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，定性资料分析方法主要使用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MSI在CRC中的检测结果

与正常结直肠黏膜对比，210例CRC癌组织标本中MSI-H的发生率为13.3%，MSI-L的发生率为0.9%，MSS的发生率为85.7%，其中28例MSI-H的CRC同时存在Bat26与Bat25的位点改变，10例存在D2S123位点的改变，11例存在D17S250位点的改变，4例存在D5S346位点的改变，只有2例5个位点均存在改变（表2）。

2.2 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达

PD-L1在CRC癌组织的阳性率为18.6%，对照组的50例癌旁正常黏膜PD-L1阳性率为6.0%，统计分析显示PD-L1在CRC中肿瘤组织的阳性率高于癌旁正常组织（P＜0.05，表3，图1）。

表1 MSI引物及特征Table 1 MST primers and characteristics

表1 MSI引物及特征（续表1）Table 1 MSI primers and characteristics

表2 CRC的MSI检测结果Table 2 Detection of MSI in CRC

表3 PD-L1在CRC中肿瘤组织与癌旁组织中的表达Table 3 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

2.3 PD-L1与CRC临床病理特征的相关性

分析显示PD-L1在CRC中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤部位、组织学类型、浸润深度和病理分期之间差异无统计学意义（P＜0.05）；仅在分化程度上差异具有统计学意义（表4，P＜0.05）。

2.4 PD-L1在MSI-H的CRC和MSI-L/MSS的CRC中的表达情况

在MSI-H的CRC中，PD-L1阳性率为75.8%；在MSI-L/MSS的CRC中，PD-L1阳性率为9.3%，两组比较差异具有统计学意义（表5，P＜0.05）。

图1 PD-L1在CRC癌组织与癌旁正常组织中的表达Figure 1 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

表4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表4 PD-L1与CRC的临床病理特征关系（续表4）Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表5 PD-L1在MSI-CRC中的表达Table 5 Expression of PD-L1 in MSI-CRC

3 讨论

CRC是全球常见的消化道恶性肿瘤，与西方国家相比，CRC在中国的发病率相对较低，但是随着社会经济的发展、生活环境的改变、人民生活习惯的变化等，该病在国内的发病率逐年上升，且趋于年轻化［9］。因此，研究CRC的发病机制、治疗和预防，对降低CRC的发病具有重要的临床价值。近几年来，随着对肿瘤发病机制的研究不断深入，对癌基因和抑癌基因的进一步了解，CRC的治疗已经从外科治疗为主、放化疗为辅的综合治疗转向了精准化、个体化治疗理念，应运而生的生物治疗、基因治疗、免疫治疗越来越受到重视［10-13］。

本研究结果显示，PD-L1在癌组织与正常组织之间表达存在显著性差异，PD-L1在癌组织中均存在阳性表达率升高。PD-L1在CRC表达的临床病理特征仅与分化程度相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。

PD-L1在MSS的CRC中，PD-L1的阳性表达与MSS的CRC有无淋巴结转移无关（P＞0.05），与病理分期无关（P＞0.05），但PD-L1在分化程度低的MSS的CRC中阳性率显著高于中、高分化组（P＜0.05）。

进一步分析发现PD-L1在MSS的CRC中阳性表达率为9.3%，而Droeser等［14］研究显示，PD-L1在MSS的CRC中表达率为37%，造成这种差异的原因，可能是入组病例数量过少，但在PD-L1表达与肿瘤的低分化，缺少淋巴结转移等临床病理特征与本研究相同，而对于病理分期早的特点在本研究中并未得出相同的结论。

PD-L1是细胞毒性免疫应答的关键抑制剂，肿瘤细胞上PD-L1的表达可以被免疫微环境诱导，导致肿瘤的免疫逃避以及预后不良。Llosa等［15］研究发现，在CRC的免疫微环境中富含活化的Th1、CTL（细胞毒性T淋巴细胞），在错配修复中存在缺陷，为了平衡这种活性Th1/CTL的微环境，MSI CRC选择性地上调某些免疫检查点的表达，其中就包括有PD-L1。Rosenbaum等［16］对结直肠癌的研究发现，PD-L1抑制反应与微卫星不稳定性相关。本研究中，MSI-H的CRC患者癌组织中PD-L1中呈高表达（PD-L1阳性为75.8%），与上述研究成果一致，同时进一步证实了Li等［17］的研究结果，即PD-L1与CRC患者的预后有关。虽然目前国内的相关研究较少，但是本研究结果为这一设想提供了理论依据，且相关的临床研究仍在继续开展中。

综上所述，本研究对PD-L1在结直肠癌中的表达进行了初步研究，证实PD-L1在部分CRC癌组织中阳性表达，尤其是在MSI-H的CRC患者中其阳性率显著高于MSI-L及MSS的CRC。根据本研究结果推论，在临床实践中，PD-L1阻断剂对MSI-H的CRC患者疗效可能更好。

[1]Shen YC,Shi YK,Han XH.Advances in targeted therapy of colorectal cancer[J].Chin J Patho,2015,44(6):430-433.[沈胤晨,石远凯,韩晓红.结直肠癌靶向治疗研究进展[J].中华病理学杂志,2015,44(6):430-433.]

[2]Chinese Medical Association digestive endoscopy credits,China Anti-Cancer Association of Cancer Endoscopy professional committee.China early colorectal cancer screening and endoscopic diagnosis and treatment guidelines(2014,Beijing)[J].Chin J Med,2015,95(28):2235-2252.[中华医学会消化内镜学分会,中国抗癌协会肿瘤内镜学专业委员会.中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南(2014,北京)[J].中华医学杂志,2015,95(28):2235-2252.]

[3]Tao L,Rui M,Jiye Z,et al.Blockade of the OX40/OX40L pathway and induction of PD-L1 synergistically protects mouse islet allografts from rejection[J].Chin Med J(Engl),2014,127(14):2686-2692.

[4]Zhang N,Zeng YY,Huang JA.Advances in the study of PD-1/PD-L1 in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Chin J Med,2016,96(24):1951-1953.[张楠,曾园园,黄建安.免疫卡控点分子PD-1/PD-L1在非小细胞肺癌治疗中的研究进展[J].中华医学杂志,2016,96(24):1951-1953.]

[5]Wang L,Wu CP,Jiang JT.Expression of co-stimulatory molecules PD-L1,B7-H3 and B7-H4 in ovarian cancer and its significance[J].J Clin Oncol,2013,18(7):663-667.[王丽,吴昌平,蒋敬庭.协同刺激分子PD-L1、B7-H3与B7-H4在卵巢癌中的表达及其意义[J].临床肿瘤学杂志,2013,18(7):663-667.]

[6]Ye YT,Wang C,Sun B.Advances in the study of PD-1/PD-L1 inhibitors in tumor immunotherapy[J].Chin J Clin Oncol,2015,(24):1178-1182.[叶因涛,王晨,孙蓓.PD-1/PD-L1抑制剂在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J].中国肿瘤临床,2015,42(24):1178-1182.]

[7]Yao HW,Liu YH.The seventh edition of colorectal cancer TNM staging(2010)updated content interpretation[J].Chin J Surg,2010,48(21):1601-1604.[姚宏伟,刘荫华.第7版结直肠癌TNM分期(2010)更新内容解读[J].中华外科杂志,2010,48(21):1601-1604.]

[8]Yang J,Kang AJ,Su BS,et al.Advances in Immunohistochemical Detection[J].Chin J Clinicians,2014,27(8):3699-3703.[杨军,康安静,苏宝山,等.免疫组织化学检测结果判读进展[J].中华临床医师杂志,2014,27(8)3699-3703.]

[9]Zhang PT.Screening,diagnosis and treatment of early colorectal cancer and precancerous lesion in China[J].Chin J Med Inform,2016,31(17):14.[张澍田.中国早期结直肠癌及癌前病变筛查与诊治[J].中华医学信息导报,2016,31(17):14.]

[10]Yu HC,Luo YX,Wang XL,et al.Effects of recurrence types on postoperative long-term survival after rectal cancer[J].Chin J Med,2016,96(8):625-628.[禹汇川,骆衍新,王小琳,等.直肠癌根治术后的复发类型对复发后远期生存的影响[J].中华医学杂志,2016,96(8):625-628.]

[11]Pi YN,Xiao Y,Wang ZF,et al.Effect of neoadjuvant chemotherapy and chemotherapy on anorectal function in patients with low rectal cancer[J].Chin J Med,2014,94(24):1857-1860.[皮艳娜,肖毅,王智凤,等.新辅助放化疗对中低位直肠癌患者肛门直肠功能的影响[J].中华医学杂志,2014,94(24):1857-1860.]

[12]Seledtsova GV,Shishkov AA,Kaschenko EA,et al.Xenogeneic cellbased vaccine therapy for colorectal cancer:Safety,association of clinical effects with vaccine-induced immune responses[J].Biomed Pharmacother,2016,83:1247-1252.

[13]Halama N,Zoernig I,Berthel A,et al.Tumoral immune cell exploitation in colorectal cancer metastases can be targeted effectively by Anti-CCR5 therapy in cancer patients[J].Cancer Cell,2016,29(4):587-601.

[14]Droeser RA,Hirt C,Viehl CT,et al.Clinical impact of programmed cell death ligand 1 expression in colorectal cancer[J].Eur J Cancer,2013,49(9):2233-2242.

[15]Llosa NJ,Cruise M,Tam A,et al.The vigorous immune microenvironment of microsatellite instable colon cancer is balanced by multiple counter-inhibitory checkpoints[J].Cancer Discov,2015,5(1):43-51.

[16]Rosenbaum MW,Bledsoe JR,Morales-Oyarvide V,et al.PD-L1 expression in colorectal cancer is associated with microsatellite instability,BRAF mutation,medullary morphology and cytotoxic tumorinfiltrating lymphocytes[J].Mod Pathol,2016,29(9):1104-1112.

[17]Li Y,Liang L,Dai W,et al.Prognostic impact of programed cell death-1(PD-1)and PD-ligand 1(PD-L1)expression in cancer cells and tumor infiltrating lymphocytes in colorectal cancer[J].Mol Cancer,2016,15(1):55.

（2017-01-13收稿）

（2017-06-22修回）

Relationship between expression of PD-L1 and microsatellite instability of colorectal cancer and its significance

Wen FENG1,Xinxin WU2,Yongjun GUO1,Yuxi CHANG1,Qingxin XIA1

Qingxin XIA;E-mail:13838173710@139.com
1Department of Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China;2Departrment of Molecular Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 in colorectal cancer(CRC).Methods:A total of 210 CRC patients who accepted radical surgery in our hospital from January 2015 to January 2016 were divided into three groups,namely,high-frequency microsatellite instability(MSI-H),low-frequency microsatellite instability(MSI-L),and microsatellite stable(MSS).The expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry,and the expression characteristics of PD-L1 in different types of CRC were analyzed.Results:CRC cases with low differentiation had a higher expression of PD-L1 than CRC patients with high differentiation(P＜0.05).PD-L1 had a positive rate of 75.8%in the MSI-H group and a rate of 9.3%in the MSI-L and MSS groups,wherein the difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).Conclusion:PD-L1 was positively expressed in some CRC tumor tissues,and its positive rate was significantly higher in MSI-H than in MSI-L and MSS.The therapeutic effect of a PD-L1 blocker for patients with MSI-H CRC might be preferable.

PD-L1,colorectal cancer,immunohistochemistry,significance

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.055

①郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）病理科（郑州市450003）；②分子病理科

夏庆欣 13838173710@139.com

冯稳 专业方向为消化道和胸部肿瘤的病理研究与诊断。

E-mail：manfengwen@126.com