双表型肝细胞癌新亚型的临床病理学研究进展*

王瀚 丛文铭

·国家基金研究进展综述·

双表型肝细胞癌新亚型的临床病理学研究进展*

王瀚 丛文铭

双表型肝细胞癌（dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC）是近年报道的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的一种新亚型，以组织学上为典型的肝细胞癌但同时表达肝细胞癌和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）的基因标志物为特征，因其具有HCC和ICC的双重生物学行为，恶性程度更高，临床预后差，因而正确诊断十分重要。CK19是DPHCC诊断的重要标志物之一，可以通过多种途径参与DPHCC的发生和恶性生物学行为的调控。本文拟从DPHCC的临床病理特点、免疫组织化学标记、组织起源发生等方面对DPHCC的研究进展进行综述。

双表型肝细胞癌 诊断 CK19 组织发生 肿瘤异质性

双表型肝细胞癌（dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC）是2011年报道的肝细胞癌（hepa⁃tocellular carcinoma，HCC）的一种新亚型，发生率约占HCC的10%［1］。DPHCC是指在组织病理学上表现为典型的HCC，但以同时表达任意HCC标志物（如Hep Par-1、pCEA、GPC-3等）和任意肝内胆管癌（intrahe⁃patic cholangiocarcinoma，ICC）标志物（如CK19/CK7、MUC-1、CA19-9等）为基本特征，因具有HCC和ICC的双重生物学行为，微血管侵犯和肝内外转移的发生率更高，临床预后更差，因此正确诊断十分重要。本文拟从DPHCC的诊断、免疫组织化学特点、组织起源等方面对DPHCC的研究进展进行综述。

1 DPHCC的临床病理特点

与普通型HCC患者的一般临床表现相比，DPHCC患者在发病年龄、HBV感染病史、血清AFP含量升高等方面无显著差异。但由于DPHCC细胞同时开放HCC看家基因AFP和ICC看家基因CA19-9，因而部分DPHCC患者可出现血清AFP和CA19-9含量同时升高的独特现象，提示DPHCC的可能，而DPHCC患者的转移风险和复发风险更高，临床预后更差。在病理学上，DPHCC在组织学及细胞学上呈现出典型的HCC特征，如癌细胞呈多边形，胞浆丰富嗜酸性，排列成肝板样梁索状结构，梁索间有血窦相隔。因而，DPHCC的诊断主要依赖于免疫组织化学检查，当肿瘤具有单一的HCC成分，同时强表达任意一种HCC和ICC蛋白标志物的癌细胞数量＞15%时，可诊断为DPHCC［1］。从理论上讲，术前肝穿刺组织做免疫组织化学检查有可能会发现DPHCC，但由于HCC具有高度的肿瘤异质性，因此穿刺小组织标本诊断DPHCC可能会有较高的假阴性。

需要提出的是，DPHCC在一个肿瘤结节内仅表现出单一的HCC组织学成分，但DPHCC细胞呈双向分化和双向基因开放的特点，因此可同时表达HCC和ICC的蛋白标志物［1-4］。这不同于经典的肝细胞癌-胆管癌混合型肝癌（combined hepatocellular chol⁃angiocarcinoma，CHC），后者是指在一个肿瘤结节内含有明确的HCC和ICC两种组织学成分，并分别表达HCC和ICC的免疫组织化学标志物［5］。DPHCC的诊断和鉴别诊断要点见表1。

2 CK19在DPHCC发生中的意义

免疫组织化学标记是诊断DPHCC的主要方法，相比较于CK7和MUC-1等胆管细胞标志物，CK19显示出较高的敏感性和特异性，是病理学诊断胆管癌和DPHCC的最常用标志物之一。从对DPHCC的检测结果看，Hep Par-1和pCEA的阳性率分别为89.7%和91.0%；CK19、MUC-1和CA19-9的阳性率分别为80.6%、38.7%和20.7%，可以酌情组合使用上述标志物以提高 DPHCC 的检出率［1，6］。Kim 等［6］对 137 例HCC组织微阵列检测发现，92%的CK19阳性HCC细胞共表达至少1种肝脏祖细胞（hepatic progenitor cells，HPC）标志物，而其他HPC标志物如EpCAM、ckit、CD133等蛋白单独表达更为常见，提示CK19较其他HPC标志物的特异性更高。目前也有研究试图探索 DPHCC 的术前诊断，Kawai等［7］发现CK19阳性HCC细胞与葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter-1，GLUT1）的表达和脱氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose，FDG）的蓄积呈正相关，CK19可以通过TGFβ/Smad通路及其下游的靶基因GLUT1来调控HCC细胞对18FFDG的摄取。因此，设想可采用18F-FDG-PET影像学检测方法来评估HCC组织中CK19的表达状况，进而为建立CK19阳性HCC的新型靶向治疗策略提供依据。

表1 DPHCC、HCC、ICC和CHC的诊断和鉴别诊断要点Table 1 Diagnostic and differential diagnosis of DPHCC,HCC,ICC,and CHC

CK19不仅是诊断DPHCC的重要标志物，同时也是提示DPHCC恶性生物学行为和不良预后的重要指标。本研究组对1 530例手术切除HCC样本的观察发现，DPHCC占HCC的10.1%，且DPHCC相比于普通型HCC的分化程度更差，包膜侵犯（61.3%vs.34.0%）、卫星灶（65.2%vs.29.9%）和癌栓（54.2%vs.30.2%）发生率更高。DPHCC患者的总生存期（over⁃all survival，OS）为（30.4±3.7）个月，无瘤生存期（recur⁃rence-free survival，RFS）为（13.2±2.0）个月，均分别显著低于普通型HCC的（43.6±3.9）个月和（23.4±2.5）个月。相比于其他ICC标志物，CK19的表达是OS和RFS的独立危险因素［1］。Feng等［8］对一组多中心346例HCC标本的分析发现，CK19阳性HCC占19.94%，具有更加恶性的生物学行为，肝内转移（44.92%vs.23.1%）、微血管侵犯（62.32%vs.41.16%）、淋巴结转移（10.14%vs.2.53%）和远处转移（11.59%vs.1.08%）更为常见，OS和累积RFS更短。Fatourou等［9］对89例HCC样本的研究发现，CK19阳性HCC占10.11%，CK19表达与否与微血管侵犯的发生（87.5%vs.51.6%）呈正相关，同时也是OS（OR=3.845）和RFS（OR=7.84）的独立危险因素。此外，Miltiadous等［10］对132例超米兰标准接受肝移植患者的研究显示，CK19阴性的HCC肝移植患者与符合米兰标准的HCC肝移植患者的术后5年生存率无显著差异，但CK19阳性患者相比于CK19阴性患者的5年生存率要更低（19.4%vs.53.1%），这一研究结果也为HCC患者肝移植适应证和受体的科学选择提供了新指标。

CK19可以通过多条途径参与DPHCC恶性生物学行为的调控。Kim等［5］通过对43例HCC的实时定量逆转录PCR的研究发现，过表达CK19 mRNA的HCC的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）相关基因（如Snail、Twist）和侵袭相关基因（如uPAR、MMP2）的mRNA表达量更高，并与CK19 mRNA表达水平呈正相关。Govaere等［11］报道，CK19阳性的HCC过表达侵袭/转移相关标志物（如VASP、TACSTD2、LAMB1）、胆管上皮细胞/HPC相关标志物（如CD133、GSTP1、NOTCH2）以及miRNA 200家族成员（如miR-141、miR-200c），而且CK19阳性HCC细胞的侵袭性和化疗药物抵抗性更强，敲除CK19基因的HCC细胞株的侵袭性则会明显降低，对5-氟尿嘧啶、多柔比星和索拉非尼的耐药性也会随之显著下降。Kawai等［12］通过对外源增强CK19基因表达的人HCC细胞系的研究发现，这类HCC细胞表现出高增殖活性和对5-氟尿嘧啶耐药性，将这类HCC细胞移植到免疫抑制小鼠体内，能促进EMT和TGFβ/Smad通路的激活，也可通过CK19基因敲除或TGFβR1抑制剂治疗而抑制该通路的活性，因而CK19可能是一个有潜在治疗价值的分子靶点。Takano等［13］通过3种人HCC细胞系（HepG2、Huh-7和PLC/PRF5）的研究发现，人HCC细胞系在CK19基因沉默后可上调E-cadherin基因的表达、下调血管生成相关基因（如VASH1、VASH2、FGFR1）的表达，提示EMT和血管生成相关基因可能是CK19阳性HCC的重要治疗靶点。

3 DPHCC的起源

从目前研究结果看，DPHCC的起源可能主要涉及两种起源方式：HPC起源模式和HCC去分化模式。

3.1 HPC起源模式

鉴于DPHCC同时表达肝细胞标志物和胆管上皮细胞标志物，因此DPHCC可能来源于具有双向分化潜能的 HPC［1，3］。HPC（在啮齿类动物中称为卵圆细胞）是肝脏的储备细胞，具有肝细胞与胆管上皮细胞双向分化潜能，主要在肝脏损伤时发挥修复作用［14-16］，已有许多研究显示，HPC与HCC的发生密切相关［17-19］。

Lee等［20］通过对小鼠HPC、成熟肝细胞与人HCC细胞系的基因表达数据的交叉对比研究发现，部分过表达HPC标志物CK7和CK19的HCC细胞与小鼠在13～16天胚胎发育期的HPC基因表达相同，提示表达CK19的HCC细胞可能来源于具有双向分化潜能的HPC。HCC组织中肝细胞核因子-1β（hepato⁃cyte nuclear factor-1beta，HNF-1β）的表达程度与CK7和CK19的表达程度呈正相关，而HNF-1β是骨桥蛋白（osteopontin，OPN）基因表达的调控因子，OPN则是HPC增殖、迁移、分化与癌变的重要调节因子［21，22］。因此，推测HPC有可能在HNF-1β和OPN的调控下形成CK19阳性HCC。Govaere等［23］对18例HCC的分析发现，层粘蛋白laminin-332存在于形态学上类似HPC的HCC细胞周围，能够提高HCC细胞CK19的表达。鉴于laminin是构成HPC细胞外微环境的重要细胞外基质蛋白并对HPC表型的维持起到重要作用，也提示CK19阳性HCC可能起源于HPC。

3.2 HCC去分化模型

肿瘤异质性是肿瘤在生长过程中，子代肿瘤细胞出现了基因或者表观遗传学等发面的变异，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、药物抗性等方面发生显著差异［24］。肿瘤异质性也普遍存在于HCC中［25］，DPHCC组织中并非所有癌细胞均表达CK19等ICC标志物，也说明DPHCC同样存在显著的肿瘤异质性。

Kowalik等［26］对肝细胞抵抗型（resistant-hepato⁃cyte，R-H）和胆碱-甲硫氨酸缺乏型（choline-methio⁃nine deficient，CMD）两种大鼠HCC模型的研究发现，CK19阳性HCC中表达CK19的细胞并非HPC（卵圆细胞）克隆扩增的结果，而是癌前病变中的成熟肝细胞在恶性转化和生物侵袭性增强的过程中逐渐表达CK19。他们观察到，尽管HCC表达CK19，但是其癌前病灶的CK19是阴性的，只是在HCC发展的过程中，部分HCC细胞开始表达CK19，提示CK19的表达是HCC去分化的结果而不是HPC的标志物。另外，CK19阴性的HCC癌前病灶与HPC的基因表达谱不同。Lai等［27］对57例HCC经肝动脉化疗栓塞（trans⁃catheter arterial chemoembolization，TACE）后手术切除样本的研究发现，TACE治疗部位的HCC细胞过表达低氧标志物CAIX，同时也表达CK19，但未治疗肿瘤区域的癌细胞则不表达CAIX和CK19，提示TACE造成的低氧环境，能够诱导CK19阴性HCC细胞转化为CK19阳性HCC细胞，提示CK19阳性HCC是因HCC在经历了低氧打击后经去分化途径转变而来。因此，DPHCC的发生也有可能是在HCC内部存在高度异质性的背景下，部分HCC细胞发生去分化的结果，对此还需要进一步开展深入研究。

4 结论

DPHCC作为HCC的一种新亚型，因其高度恶性的生物学特性与不良的预后而具有重要的临床诊治意义。DPHCC的精细分型可为临床提高对HCC亚型的认识和治疗水平提供重要的病理学依据。ICC标志物CK19基因的开放和表达是DPHCC的重要分子特征，CK19参与了DPHCC相关信号通路的激活与抑制，增强了DPHCC的增殖活性和侵袭与转移能力，是判断HCC恶性程度、预测复发风险和评估临床预后的重要生物标志物。由于CK19与药物的耐药性和敏感性相关，CK19有可能成为DPHCC分子靶向治疗的重要靶点。

综上所述，DPHCC是研究HCC异质性、克隆起源、组织发生、分子分型和靶向治疗的重要病理模型，值得关注。今后应在DPHCC的生物学行为特点、起源发生机制和临床治疗策略等方面开展深入研究，以进一步丰富DPHCC的理论认识和提高临床HCC亚型的诊治水平。

[1]Lu XY,Xi T,Lau WY,et al.Hepatocellular carcinoma expressing cholangiocyte phenotype is a novel subtype with highly aggressive behavior[J].Ann Surg Oncol,2011,18(8):2210-2217.

[2]Cong WM,Bu H,Chen J,et al.Practice guidelines for the pathological diagnosis of primary liver cancer:2015 update[J].World J Gastroenterol,2016,22(42):9279-9287.

[3]Cong WM,Wu MC.New insights into molecular diagnostic pathology of primary liver cancer:Advances and challenges[J].Cancer Lett,2015,368(1):14-19.

[4]Cong WM.Dual-phenotype hepatocellular carcinoma[M]//Surgical Pathology of Hepatobiliary Tumors.Beijing:People's Medical Publishing House,2015:318-319.[丛文铭.双表型肝癌[M]//肝胆肿瘤外科病理学.北京:人民卫生出版社,2015:318-319.]

[5]Theise ND,Nakashima O,Park YN,et al.Combined hepatocellularcholangiocarcinoma[M]//Bosman FT,Carneiro F,Hruban RH,Theise ND eds.WHO classification of tumours of the digestive system.Lyon:IARC Press.2010:225-227.

[6]Kim H,Choi GH,Na DC,et al.Human hepatocellular carcinomas with"Stemness"-related marker expression:keratin 19 expression and a poor prognosis[J].Hepatology,2011,54(5):1707-1717.

[7]Kawai T,Yasuchika K,Seo S,et al.Identification of keratin 19-positive cancer stem cells associating human hepatocellular carcinoma using 18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography[J].Clin Cancer Res,2016,23(6):1450-1460.

[8]Feng J,Zhu R,Chang C,et al.CK19 and Glypican 3 expression profiling in the prognostic indication for patients with HCC after surgical resection[J].PLoS One,2016,11(3):e0151501.

[9]Fatourou E,Koskinas J,Karandrea D,et al.Keratin 19 protein expression is an independent predictor of survival in human hepatocellular carcinoma[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2015,27(9):1094-1102.

[10]Miltiadous O,Sia D,Hoshida Y,et al.Progenitor cell markers predict outcome of patients with hepatocellular carcinoma beyond Milan criteria undergoing liver transplantation[J].J Hepatol,2015,63(6):1368-1377.

[11]Govaere O,Komuta M,Berkers J,et al.Keratin 19:a key role player in the invasion of human hepatocellular carcinomas[J].Gut,2014,63(4):674-685.

[12]Kawai T,Yasuchika K,Ishii T,et al.Keratin 19,a cancer stem cell marker in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2015,21(13):3081-3091.

[13]Takano M,Shimada K,Fujii T,et al.Keratin 19 as a key molecule in progression of human hepatocellular carcinomas through invasion and angiogenesis[J].BMC Cancer,2016,16(1):903.

[14]Lanzoni G,Cardinale V,Carpino G.The hepatic,biliary,and pancreatic network of stem/progenitor cell niches in humans:A new reference frame for disease and regeneration[J].Hepatology,2016,64(1):277-286.

[15]Lu WY,Bird TG,Boulter L,et al.Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity[J].Nat Cell Biol,2015,17(8):971-983.

[16]Shin S,Upadhyay N,Greenbaum LE,et al.Ablation of Foxl1-Cre-labeled hepatic progenitor cells and their descendants impairs recovery of micefromliver injury[J].Gastroenterology,2015,148(1):192-202e193.

[17]Xue F,Hu L,Ge R,et al.Autophagy-deficiency in hepatic progenitor cells leads to the defects of stemness and enhances susceptibility to neoplastic transformation[J].Cancer Letters,2016,371(1):38-47.

[18]Serrano F,García-Bravo M,Blazquez M,et al.Silencing of hepatic fate-conversion factors induce tumorigenesis in reprogrammed hepatic progenitor-like cells[J].Stem Cell Res Ther,2016,7:96.

[19]DePeralta DK,Wei L,Ghoshal S,et al.Metformin prevents hepatocellular carcinoma development by suppressing hepatic progenitor cell activation in a rat model of cirrhosis[J].Cancer,2016,122(8):1216-1227.

[20]Lee J-S,Heo J,Libbrecht L,et al.A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells[J].Nat Med,2006,12(4):410-416.

[21]Yu DD,Jing YY,Guo SW,et al.Overexpression of hepatocyte nuclear factor-1beta predicting poor prognosis is associated with biliary phenotype in patients with hepatocellular carcinoma[J].Sci Rep,2015,5:13319.

[22]Liu Y,Cao L,Chen R,et al.Osteopontin promotes hepatic progenitor cell expansion and tumorigenicity via activation of beta-catenin in mice[J].Stem Cells,2015,33(12):3569-3580.

[23]Govaere O,Wouters J,Petz M,et al.Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche[J].J Hepatol,2016,64(3):609-617.

[24]McGranahan N,Swanton C.Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution[J].Cancer Cell,2015,27(1):15-26.

[25]Xue R,Li R,Guo H,et al.Variable intra-tumor genomic heterogeneity of multiple lesions in patients with hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,2016,150(4):998-1008.

[26]Kowalik MA,Sulas P,Ledda-Columbano GM,et al.Cytokeratin-19 positivity is acquired along cancer progression and does not predict cell origin in rat hepatocarcinogenesis[J].Oncotarget,2015,6(36):38749-38763.

[27]Lai JP,Conley A,Knudsen BS,et al.Hypoxia after transarterial chemoembolization may trigger a progenitor cell phenotype in hepatocellular carcinoma[J].Histopathology,2015,67(4):442-445

（2017-01-18收稿）（2017-04-23修回）

（编辑：郑莉 校对：武斌）

Research progress on clinicopathology in dual-phenotype hepatocellular carcinoma

Han WANG,Wenming CONG

Wenming CONG;E-mail:wmcong@smmu.edu.cn
Department of Pathology,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Second Military Medical University;Key Laboratory of Signaling Regulation and Targeting Therapy of Liver Cancer,Second Military Medical University,Ministry of Education;Shanghai Key Laboratory of Hepatobiliary Tumor Biology,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Shanghai 200438,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81472278)and Funds for Creative Research Groups of National Natural Science Foundation of China(No.81521091)

Dual-phenotype hepatocellular carcinoma(DPHCC)is a novel subtype of hepatocellular carcinoma(HCC).DPHCC presents the classical morphology of HCC but simultaneously expresses the biomarkers of HCC and intrahepatic cholangiocarcinoma(ICC).Accurate diagnosis of DPHCC is necessary because of its combined biological behaviors of HCC and ICC,highly malignant degree,and infaust clinical prognosis.CK19 is an important marker of DPHCC and regulates the clonal origin and biological behavior of DPHCC in various pathways.In this paper,we reviewed the research progress of DPHCC focusing mainly on its clinicopathological features,immunohistochemical biomarkers,and histogenesis.

DPHCC,diagnosis,CK19,histogenesis,tumor heterogeneity

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.071

第二军医大学东方肝胆外科医院病理科，教育部重点实验室（肝癌分子网络调控与靶向干预），上海市肝胆肿瘤生物学重点实验室（第二军医大学东方肝胆外科医院）（上海市200438）

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81472278）和国家自然科学基金委创新群体基金（编号：81521091）资助

丛文铭 wmcong@smmu.edu.cn

王瀚 专业方向为肝胆肿瘤病理学。

E-mail：ehbhwanghan@126.com