循环肿瘤细胞检测与结直肠癌复发转移的研究进展

白东晓 综述 杨海军 审校

·综 述·

循环肿瘤细胞检测与结直肠癌复发转移的研究进展

白东晓①综述 杨海军②审校

结直肠癌发病率在逐年上升，转移和复发是结直肠癌死亡的主要原因。血液循环中的肿瘤细胞可能具有增生能力或转移潜能，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的检测为预测评估复发转移及疗效、肿瘤分期及个体化治疗提供了一个可靠手段，随着检测技术的不断优化发展，将为临床提供更好的支持。本文旨在对CTC检测与结直肠癌复发转移等方面的研究进展进行综述。

循环肿瘤细胞 结直肠癌 检测技术 复发转移 肿瘤分期 疗效评估

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是指存在于血液循环中的肿瘤细胞和转移来源的细胞。在结直肠癌患者血液中的CTC不仅包括上皮肿瘤细胞，也包括经历上皮间质转化（epithelial-mesenchy⁃mal transition，EMT）的肿瘤细胞和肿瘤干细胞［1］。大量早期的结直肠癌患者虽然经过根治性手术，但仍发生复发转移，这提示一些具有生命力的肿瘤细胞包括具有增生能力或转移潜能的肿瘤细胞被释放入血液。CTC的检测将有助于肿瘤的分期诊断以及评估转移复发的可能性，为个体化治疗提供依据，并且可以观察辅助治疗的效果。本文旨在对结肠直肠癌CTC的研究进展进行综述。

1 CTC

尽管实体肿瘤能够脱落数以百万计的肿瘤细胞进入血液［2］，但所检测到的肿瘤细胞却寥寥无几。因为大部分的肿瘤细胞在循环过程中发生凋亡或很快被血液中的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞所杀伤吞噬。恶性肿瘤细胞为获得运动性和侵袭性，会丢失某些上皮细胞的表型，包括形态、表面抗原、基因表达等，并获得某些间充质细胞的表型，这就是EMT。

有研究表明，CTC多个基因的表达改变与结直肠癌细胞的转移迁徙有关，如TSPAN8［3］、CD44v6［4］、CD151［5］的下调，具有很强的细胞毒性和噬菌性的钙网蛋白的下调［6］，以及过度表达CD47的无免疫表型［7-8］。已有研究证明，骨髓中的CD47阳性CTC与肿瘤的复发有关［9-10］。发生基因表达改变的CTC能够避开免疫细胞的细胞毒性及吞噬。

多数恶性肿瘤细胞在脱离原发病灶的过程中发生EMT。关于EMT发生的机制，有研究报道能诱发EMT转换的信号可以通过蛋白磷酸化机制，如TGF-β信号通路导致的PAR6A蛋白磷酸化，破坏紧密连接和桥粒连接［11］。还可以通过抑制某些蛋白的表达水平，如ZEB1抑制血小板亲和蛋白3来诱发EMT转换。细胞外基质的重构也能触发EMT过程［12］。CTC cluster是指3个或3个以上的CTC聚集在一起形成的肿瘤细胞聚合体。CTC cluster与间质细胞表型密切相关，并且高比例的间质细胞表型CTC与化疗耐药有关［13］。研究显示CTC cluster比单个肿瘤细胞具有更强的转移潜能［14］。Aceto等［15］研究指出，外周血检出CTC cluster的患者较仅检出单个CTC患者转移风险高23～50倍。

2 结直肠癌CTC的检测方法的进展

结直肠癌CTC的检测方法，根据检测原理可分为细胞计量术及基于核苷酸的检测方法。根据检测前是否采用免疫磁珠等技术富集血液标本中的肿瘤细胞而将所有的检测方法分为阳性富集法和阴性富集法。

2.1 细胞计量术及基于核苷酸的检测方法

前者包括各种免疫细胞化学技术、免疫磁珠分离技术、流式细胞术（flow cytometry，FCM）、基于癌细胞大小的分离方法等。后者包括多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），逆转录多聚酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）及其各种改进的技术如Southern blot杂交、Northern blot杂交肽配体筛选的技术等。主要是基于抗原抗体，EMT原理来筛选阳性细胞CTC细胞，PCR、Northern、FISH等后续检测方法。目前，应用较多的是RT-PCR，其具有高度的敏感性和特异性，但由于RNA易被RNA酶降解，同时该方法具有PCR技术的局限性，仍可出现假阳性和假阴性结果。

FCM以流式细胞仪为工具对悬液中的细胞进行测量分析，具有快速、准确的优点，尽管FCM不能提供有关细胞形态方面的信息，但其在鉴定、计数肿瘤细胞方面比RT-PCR更可靠。其缺点为FCM需取约50 mL外周血方可检测CTC。

2.2 细胞富集术

根据检测前是否采用免疫磁珠等技术富集血液标本中的肿瘤细胞而将所有的检测方法分为阳性富集法和阴性富集法。哈佛大学韦斯研究所仿生工程与波士顿AOS医院之间合作研究创造一种微流体装置，可以收集稀少的CTCs，以便进一步进行血液分析。这种阳性富集法方法采用细胞分离装置与微磁学和微流体相结合捕捉和培养CTCs，磁珠有选择性地涂布CTCs以便分离血液中的其他细胞［16］。但进一步测试发现该设备对检测CTCs的数量不够敏感。有研究采用一种改进的微流体系统把正常的血细胞过滤除去，留下无损伤的肿瘤细胞［17］。

Cell Search CTC检测与分析系统，能够运用免疫纳米磁颗粒专利技术对微量细胞进行分析。该系统能够对血液中的微量细胞进行精确分析，并且具有良好的可重复性和特异性，只需应用7.5 mL血液样本，即可从400多亿的血细胞中检测到一个CTC，敏感性较高。Cell Search是基于阳性选择，利用抗体包被的磁珠来捕获EpCAM阳性的细胞，然后成像并计数。2004年Cell Search CTC检测技术获得美国FDA的认证，2007年美国临床肿瘤学会（ASCO）将CTC纳入肿瘤标志物，2012年国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准Veridex CTC检测，2013年CTC检测纳入美国医保［18］。

目前，CTC检测方法较多，但检出率仍有限，仍需提高其阳性率及特异性。为避免使用单一方法检测的种种弊端，近些年多使用两种或多种方法联合检测。如采用阴性富集法、免疫荧光染色技术、FISH等方法联合检测CTC、CTC Cluster及疑似细胞。最近有报道联合应用细胞搜索系统方法提高转移性结直肠癌患者中的CTC检测率，以更好的指导临床治疗［19］。

3 检测CTC在结直肠癌临床中的意义

3.1 CTC的检测有助于肿瘤的分期

早期结直肠癌（Ⅰ期和Ⅱ期）通过根治性的外科手术治愈率可达70%［1］。在Ⅰ期和Ⅱ期结直肠癌术后腹腔灌洗液中传播肿瘤细胞阳性者的预后明显较差。Ⅲ期肿瘤患者中CTC阳性者有较短的无病生存期（disease-free survival，DFS），并且CTC的检测可以作为Ⅲ期的f分层分期的依据［20］。进展期结直肠癌，随着分期的增高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的阳性CTC细胞检测率越来越高［21］。在非转移性结直肠癌患者中，检测到的CTC平均数目随着肿瘤的T分级、N分级、肿瘤大小、分化程度的恶性升高而增加，而与患者的性别、年龄、CEA水平及大体类型无关［22］。

3.2 CTC作为结直肠癌的一个独立预后因素

CTC检测能否作为结直肠癌患者的预后指标，一项应用5个收索引擎、汇集1 847例结直肠癌患者的Meta分析［23］给出答案。应用细胞搜索系统检测外周血的CTC能够有效地评估结直肠癌患者的预后，外周血CTCs的存在与患者的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）有明确的相关性。在早期结直肠癌患者中，CTC检测与患者的预后关系尚未完全阐明，但在进展期患者中，尤其是Ⅲ期及转移性结直肠癌患者中，检测的CTC数目是一个独立预后因素［24-25］，3个或3个以上的CTC/7.5 mL比3个以下的有较短的PFS和OS。

3.3 个体化治疗的依据

在转移性结直肠癌患者，检测CTC更有意义。因为CTC的分子特征尤其在细胞黏附、EMT方面更能比原发肿瘤细胞提示远处转移的迹象［26］。有报道应用磁珠、荧光分离技术（MACS和FACS）及RT-qP⁃CR方法检测结直肠癌肝转移患者冷冻术前及术后1、7、30 d的外周血CTC数值，冷冻的术后CTC数值明显下降，与CTC相关的CEA、Ep-CAM、CK18和CK19随时间推移也明显下降，这种方法检测CTC对冷冻术的疗效评估及进展期结直肠癌的预后判定有一定价值［27］。CTC的检测，为结直肠癌个体化治疗提供一个相对可靠的依据。

3.4 治疗效果的评价

接受化疗的进展期结直肠癌患者可以通过表达CK20和存活素的CTC检测，有效地预测患者的OS［28］。结直肠癌根治术后，通常CTC水平会下降，但若仍较高水平或继续增加者，则确定提示肿瘤会复发转移，警示要优化该患者的治疗方案［29］。对于Ras-Braf野生型的进展期化疗难治患者，应用西妥昔单抗、帕尼单抗三线治疗期间，治疗早期（2～4周）CTC阳性的患者，比CTC阴性者其PFS明显缩短；治疗期间的CTC变化与OS及PFS明显相关［30］。通过对比结直肠癌患者治疗前后的CTC变化，可以判断其治疗效果。

4 结语与展望

肿瘤复发和远处转移是结直肠癌患者的主要死亡原因。如何检测微转移和早期复发是CTC检测有效与否的关键因素。目前，对肿瘤细胞的异质性、侵袭性、血液转移的机制尚未完全阐明。CTC检测在结直肠癌临床研究中已经取得一定的进展，但CTC的检测灵敏度及特异性仍有待提高。CTC检测的结果如何转化为临床应用，如对早期诊断、药敏、耐药、转移、复发等相关的不同CTC亚类细胞进行全面的基因分析，以期能够加深对肿瘤的发生、生长、转移等多方面的了解，并寻找出新的肿瘤标志物，从而提高这种“液体活检”的有效率。

综上所述，CTC检测前景良好，随着研究的不断发展，必将产生新的诊疗手段，为肿瘤的防治提供更好的支持。

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（2016-08-16收稿）

（2016-09-28修回）

Advances in circulating tumor cells detection and the colorectal cancer recurrence or metastasis

Dongxiao BAI1,Haijun YANG2

Dongxiao BAI;E-mail:ljty417bai@163.com

The occurrence rate of colorectal cancer is increasing.Metastasis and recurrence are the leading causes of death in colorectal cancer.Tumor cells in the circulation have the ability to proliferate or to migrate,thereby providing a reliable means for neoplasm staging and assessment of recurrence or metastasis,and evaluation of efficacy by detecting circulating tumor cells(CTC).Optimizing the development of detection technology will provide better support for clinical applications.This review mainly discusses CTC detection and advances in colorectal cancer relapse or metastasis.

circulating tumor cells,colorectal cancer,detection technology,recurrence and metastasis,neoplasm staging,efficacy evaluation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.966

①安阳市肿瘤医院，河南科技大学第四附属医院外四科（河南省安阳市455000）；②病理科

白东晓 ljty417bai@163.ckom

1The Fourth Surgical Department of Anyang Tumor Hospital,The Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Anyang 455000,China;2Department of Pathology,The Fourth Surgical Department of Anyang Tumor Hospital,The Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Anyang 455000,China

白东晓 专业方向为胃肠肿瘤的临床及基础研究。

E-mail：ljty417bai@163.com