液滴数字PCR在乳腺癌精准治疗中的应用

张博诚 张显玉 孙根 综述 庞达 审校

·综 述·

液滴数字PCR在乳腺癌精准治疗中的应用

张博诚①张显玉①孙根②综述 庞达①审校

在精准医学大背景下，分子分型指导下的乳腺癌个体化治疗虽已成为常态，但仍需不断寻求更加优质高效的精准治疗方案。液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）在稀有基因突变检测、拷贝数变异检测以及与下一代测序技术相整合等方面，较传统的实时荧光定量PCR表现出明显的优势。本文针对ddPCR平台在不同乳腺癌亚型中的应用，以及对ddPCR技术助力下的乳腺癌的研究进行综述。

液滴数字PCR 乳腺癌 精准治疗 基因突变 基因检测

精准医学是指根据个体的分子变异指导疾病的预防和治疗。肿瘤的精准医学研究是整合临床信息和分子生物学技术，鉴定与肿瘤生物学行为和治疗应答密切相关的分子标志物，并在设计合理的临床试验中用于验证，指导肿瘤的精准分型和治疗。乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，由分子分型指导的治疗近年来已取得初步成效，但乳腺癌的耐药和异质性问题目前仍是其基础和临床研究面临的巨大挑战。第二代实时荧光定量PCR（qPCR）最大的技术瓶颈依然是依赖Ct值、PCR扩增效率以及标准曲线，所谓的“定量”也只是相对、间接的，而且在目标核酸分子丰度低、样本间模板浓度差异细微的情况下，qPCR的检测灵敏度、精确度都受到了限制，已不能满足生命科学研究应用发展的需求。在这样的背景下，液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术应运而生。本文就对不同乳腺癌亚型中ddPCR的应用进行综述。

1 ddPCR原理及优势

ddPCR是一种检测核酸分子的绝对定量技术，ddPCR微滴发生器可将含有核酸分子的荧光PCR反应体系“分割”成数万个纳升级的微滴，核酸分子在各微滴中随机分装，每个微滴或不含、或含有至少一个目标核酸分子，每个微滴都是一个独立的PCR反应器（图1）。经PCR扩增后，微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”，从而将荧光模拟信号数字化；最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，通过分析软件可直接给出目标核酸分子的拷贝数浓度，因此不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以ddPCR受扩增效率的影响大幅度降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大幅度提高［1］。

ddPCR微滴化的过程可降低与具有竞争性作用的目标序列的浓度，实现稀有序列的富集以及痕量核酸检测。由于ddPCR采取终点判读的方法，在引物设计过程中可减少因扩增效率不合要求而造成的浪费（时间、样品、耗材等）。拷贝数变异（copy num⁃ber various，CNVs）研究需要极高的精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，ddPCR通过直接计数目标基因与参照基因（已知拷贝数）的数目并计算比值，即可得到目标基因的拷贝数［2］。目前对于检测血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）技术上可分为下一代测序（next-generation sequencing，NGS）和ddPCR两种平台。近年来NGS技术飞速发展，为进一步发挥NGS技术的优势，ddPCR可有效验证NGS技术捕获的基因突变，并且可较好地整合实验流程（图2），建立目标测序、个体生物标志物开发、化疗后外周血检测的完整研究路线［3］。

图1 ddPCR基本原理Figure 1 Basic principles of ddPCR

图2 ddPCR与NGS技术相互整合Figure 2 Integration of ddPCR and NGS technology

2 ddPCR在不同乳腺癌亚型中的应用

2.1 激素受体阳性乳腺癌

目前，约2/3的浸润性乳腺癌为Luminal A或B型，即激素受体（hormone receptor，HR）阳性乳腺癌，ddPCR在这两型乳腺癌中的研究主要是围绕内分泌治疗（endocrine therapy，ET）的耐药问题，缺乏独立分型研究，故本文以HR阳性乳腺癌进行论述。在HR阳性转移性乳腺癌中，虽然ET为一线治疗［4］，但是在反复的ET中肿瘤均产生了对雌激素的抵抗力，变成非激素依赖型。近年来，雌激素受体1（estrogen re⁃ceptor 1，ESR1）激活突变是研究的热点。通过NGS技术，发现ESR1突变的富集区在537号酪氨酸和538号天冬氨酸，即ESR1 Y537S、Y537N、Y537C、D538G，涵盖80%以上ESR1突变，并与ET抵抗相关［5-7］。为将这些发现的突变位点作为一种ET抵抗的生物标志物，应在疾病进展时同步进行ESR1基因型分析，cfD⁃NA分析就是为克服组织活检不便而建立的方法。为了在极少量的cfDNA中获取ESR1突变频率并证明其临床作用价值，在10%～30%ET耐药的HR阳性转移性乳腺癌中，应用NGS技术确认ESR1-LBD基因出现突变富集［5-6］，在原发性乳腺肿瘤（primary breast tumor，PBT）中普遍认为ESR1突变频率非常低（＜1%）或检测不到。Wang等［8］采用ddPCR技术，在43例PBT中发现ESR1 Y537S、Y537C、D538G也存在7%（3/43）的等位基因突变。同样，Takeshita等［9］在270例PBT中发现ESR1突变频率为2.6%（7/270）。这两项研究结果表明，ESR1突变频率在PBT中或NGS技术检测的阈值之下，也充分证明了ddPCR进行痕量检测的优势，以及选择不同的cut-off值可能会带来不同的分析结果。另外，Wang等［8］对4例患者cfDNA中ESR1突变频率进行了持续的监测，发现在治疗的过程中ESR1等位基因突变频率发生改变，揭示了ddPCR监测肿瘤负荷的潜能，可及时调整ET方案。

目前，在辅助治疗阶段因缺乏系统的基因组跟踪随访，辅助治疗中或治疗后HR阳性乳腺癌患者担心复发。Gu等［10］提出这样一种治疗方式，即在基线期采集HR阳性乳腺癌患者的肿瘤组织及血液样本，应用NGS技术检测相关肿瘤基因突变；新辅助治疗后，应用ddPCR检测相应的肿瘤组织和血液样本，同时与相匹配的基线期样本进行基因突变频率比较；术后则通过cfDNA进行基因突变状态监测。ESR1突变可采用ddPCR评估，其他新出现的驱动基因突变或亚克隆衍变可采用NGS技术捕获。若ESR1等位基因突变频率增加，ET方案则相应调整，这种治疗方式或更符合精准医疗的理念。

2.2 HER-2阳性乳腺癌

人表皮生长因子-2（human epidermal growth fac⁃tor receptor-2，HER-2），又称c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上，HER-2过表达可激活表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）的信号通路并促进EGFR介导的转化和肿瘤的发生。随着靶向治疗在临床中的成功应用，HER-2状态的精准检测显得尤为重要。目前，免疫组织化学（IHC）与荧光原位杂交（FISH）法作为HER-2过表达诊断的金标准，仍在临床检测中存在一些技术问题。IHC的结果判定易受检验者主观因素的影响，而FISH存在操作繁琐耗时、价格昂贵、参比位点17号染色体着丝粒（CEP17）状态并不等同于17号染色体的状态等问题，另外由于方法学本身的局限性，IHC和FISH的检测结果均有不确定性。因此，需要更精准、客观、高效的HER-2检测平台。ddPCR对石蜡包埋组织（for⁃malin-fixed and paraffin-embedded tissues，FFPET）进行HER-2基因转录水平［11］及CNVs［12］精准检测的临床应用潜力已得到证实。Belgrader等［12］应用ddPCR对39例DNA已高度降解的FFPET进行HER-2检测，结果显示10例样本中HER-2阳性，29例样本中HER-2阴性，这与FISH及IHC结果完全一致。

ddPCR同样适用于在cfDNA中检测HER-2的CNVs。Gevensleben等［13］选择1.25作为cut-off值，结果显示在11例FISH及IHC确认的HER-2阳性样本中，ddPCR检出的HER-2阳性率为64%（7/11），在47例FISH及IHC确认的HER-2阴性样本中，ddPCR检出的HER-2阴性率为94%（44/47）。其中FISH及IHC检测的组织均源于PBT，3个假阳性结果的分析显示可能是因参照基因少量的丢失，或这些患者肿瘤发生转移后真的获得了HER-2的扩增；3个假阴性结果的分析表明这种不一致性可能反映了基因组HER-2状态的改变，因所有假阴性结果的患者在肿瘤发生转移后均接受过抗HER-2治疗，可能导致肿瘤内部异质性的选择而变成非HER-2扩增型。Gar⁃cia-Murillas等［14］选择2.0为cut-off值，结果显示在18例FISH及IHC确认的HER-2阳性样本中，ddPCR检出的HER-2阳性率为100%（18/18），在58例FISH及IHC确认的HER-2阴性样本中，ddPCR检出的HER-2阴性率为98%（57/58），敏感性和特异性分别为100%和98%。应用ddPCR对HER-2的CNVs开展精准检测，理论依据充分，为下一步临床应用奠定了基础。

近期一项关于胃癌的HER-2研究中［15］，采用ddPCR对cfDNA中HER-2状态进行持续监测，揭示术前、术后或复发时HER-2状态的变化。提示曲妥珠单抗的治疗或具有时间和空间异质性，在治疗的过程中或因遗传分化伴随着肿瘤衍变，亦或化疗引起肿瘤内部异质性的选择，造成HER-2状态的改变，从而影响临床治疗决策。应用ddPCR对乳腺癌围手术期、化疗或转移前后HER-2状态进行持续监测值得借鉴。

2.3 三阴性乳腺癌

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TN⁃BC）是一种雌激素受体、孕激素受体和HER-2均不表达的乳腺癌亚型，因此不能从现有的ET及靶向治疗中获益。现阶段，化疗是TNBC的标准治疗，但其复发率及病死率仍较高［16］。TNBC是一种高度异质性的肿瘤，目前分子病理和基因表达谱是识别TNBC亚型、寻找新的治疗靶点以及发现体细胞基因突变的公认方式［17］。

PIK3CA是近年来致癌基因的研究热点，编码磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinases，PI3Ks）信号通路中的p110复合物。在乳腺癌中PIK3CA突变占20%～40%［18］，是继TP53基因之后第二常见的突变基因。一项Meta分析表明，PIK3CA突变的临床意义依据不同的乳腺癌表面受体类型而不同［19］。临床上已证实，PIK3CA突变本身对于HR阳性乳腺癌患者预后价值有限［20］，但在TNBC中关于PIK3CA突变的临床意义鲜有报道。

现已证实在TNBC中雄激素受体（AR）与PI3Ks信号通路相关，包括PIK3CA突变［21］，但AR表达与TNBC预后关系尚存争议。因此，在TNBC中检测PIK3CA突变对其预后以及对AR信号通路的影响具有重要意义。Takeshita等［22］应用ddPCR首先对49例血液样本及42例相对应的肿瘤组织样本中PIK3CA突变频率进行分析，结果显示二者之间并不相关，但这并不有损ddPCR的准确性。原因为：1）每个样本中的PIK3CA突变阳性及阴性已均由ddPCR系统Bio⁃Mark［23］证实；2）研究结果反映日益凸显的肿瘤异质性问题，ESR1突变频率在cfDNA中与肿瘤组织中的检测结果不同，可能是由肿瘤异质性所引起［24］；3）采取Cox多元风险模型分析患者的生存情况，结果显示在cfDNA中PIK3CA突变组较野生组可显著延长无复发生存时间［22］。在cfDNA中PIK3CA有望作为一种肿瘤标记物，用于评估TNBC辅助治疗的疗效。

3 结语

乳腺癌是高度异质性的肿瘤，随着分子生物学技术的发展，更多的乳腺癌易感基因及驱动基因逐渐被发现。ddPCR技术带来了全新的技术思路和研究手段，相比qPCR具有更出色的灵敏度、特异性和精确性，并且可与NGS技术相互补充整合。目前，已普遍认可ddPCR技术在痕量核酸检测、稀有基因突变检测及CNVs研究方面的技术优势。通过ddPCR平台，持续监测HR阳性乳腺癌患者的ET耐药的驱动基因，精准检测HER-2阳性乳腺癌患者中的CNVs，及与NGS技术协同发现并确认TNBC治疗的新靶点等方面都具有重要意义，并有助于进行更高层次的乳腺癌分子生物学研究。

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（2016-11-10收稿）

（2017-01-19修回）

Application of droplet digital PCR in the precision treatment of breast cancer

Bocheng ZHANG,Xianyu ZHANG,Gen SUN,Da PANG

Da PANG;E-mail:pangdasir@163.com

In the context of precision medicine,although individual treatment of breast cancer under the guidance of molecular classification has become the norm,a precision treatment program with increased efficiency and quality is still required.Compared with the traditional real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(PCR),the droplet digital PCR(ddPCR)has obvious advantages in the detection of rare mutations and copy number variations,as well as the integration with the second-generation-sequencing technology.This paper reviews the application of a ddPCR platform in different breast cancer subtypes and explores new horizons of breast cancer research through the ddPCR technology.

droplet digital PCR,breast cancer,precision treatment,gene mutation,gene detection

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.300

①哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科（哈尔滨市150081）；②肇东市人民医院外科

庞达 pangdasir@163.com

Department of Breast Cancer Surgery,Harbin Medical University Cancer Hospital,Harbin 150081,China

张博诚 专业方向为乳腺肿瘤相关临床及基础研究。

E-mail：hmubocheng@163.com